NF-κB抑制剂在破骨细胞生成和骨吸收中的作用

论文摘要

人工关节置换术是治疗各种关节疾病终末期病变最普遍而有效的方法,但随着假体使用时间延长,假体发生松动,失败率不断上升。过去一般将这种假体松动单纯归咎于假体与骨界面间的密贴欠佳、假体安装位置不良、骨水泥碎裂等力学原因。但近年来人们认识到:人工关节后期松动除上述因素外,主要与假体长期磨损或离解产生的颗粒所诱导的生物学反应有关。生物学反应过程包括:①磨损颗粒的产生;②假体-骨界面间异物反应膜的形成;③破骨细胞性骨溶解,导致假体的骨性支持结构力学性能下降。尤其是破骨细胞性骨溶解的作用被认为意义重大。因此,研究破骨细胞性骨溶解对预防假体松动具有十分重要的意义。RANKL/RANK/NF-κB被认为是介导破骨细胞分化成熟的最重要的信号通路。目前发现破骨细胞内与RANKL相关的信号转导通路主要有四条:NF-κB通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT通路。其中NF-KB通路被认为是对磨损颗粒诱导破骨细胞激活发挥最重要的作用。NF-κB抑制剂包括:PDTC （二硫代氨基甲酸吡咯烷,Pyrrolidine dithiocarbamate）,NAC（N-乙酰半胱氨酸,N-acetylcysteine）等。早期研究已证明PDTC及NAC对NF-κB激活有专一抑制作用。它们抑制NF-κB激活的机制[2]是通过抑制I-κB（静止细胞中在胞浆内与NF-κB结合,阻止其进入细胞核发挥作用）降解,使NF-κB不能转入细胞核中与其相应耙基因的启动子结合,从而不能通过启动或调控基因转录来调节破骨细胞的分化,功能。本研究是采用聚甲基丙烯酸甲脂（Polymethylmethacrylate,PMMA）颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解的动物模型体系,通过Micro-CT扫描后三维重建分析多项数据;HE染色、TRAP染色后进行图像分析,探讨NF-κB抑制剂对体内破骨细胞骨溶解功能的作用及对局部骨溶解的影响。为阐明NF-κB抑制剂对关节置换术后骨溶解的防治作用奠定新的理论基础。具体内容如下:1.小鼠颅骨骨溶解模型的建立:2%戊巴比妥钠腹腔注射,麻醉后输液胶布固定四肢及头部,新洁尔灭酊消毒头部皮肤,在颅骨正中矢状缝位置切开头皮,切口约0.5cm长,用骨刀刮除骨膜,移液管滴入PMMA颗粒悬液（30mg:0.1ml）,4-0号线缝合头部皮肤。术后小鼠笼内自由活动。自术后第二天起每日给予小鼠腹腔注射药物,术后2周处死。2. Micro-CT扫描后应用eXplore MicroView分析软件进行三维图像重建,并分析颅骨标本的BMC、BMD、BVF、CA、CMT五项数据,结果发现各项指标整体趋势大致相同。所有分析结果均表明,PDTC、NAC组比生理盐水对照组的骨密度、骨矿含量均有明显增高,用药后骨骼的硬度力学性能均有相应改善。两药物组BVF比对照组明显增大,说明骨吸收作用被抑制。CA及CMT分析也显示药物组皮质骨厚度比对照组增厚,皮质骨面积与对照组比较明显增大。这些指标都证明了药物对骨吸收有明显的抑制作用。说明药物对颗粒诱导的骨溶解有明确的抑制作用。3.制备组织切片并染色3.1 HE染色,TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色。所有组织测量均使用OsteoMeasure Analysis System,使用显微镜分别放大50×,100×,拍摄图片后进行骨组织计量学分析。指标包括:①溶解面积百分比OA（Percentage ofOsteolytic area）,OA越大表明骨溶解效应越明显;②破骨细胞数目ON（Osteo-clast number）,ON越大表明破骨细胞越多,引起骨溶解效应越大。结果发现:生理盐水对照组OA最大,显示骨溶解作用最明显。NAC药物组比PDTC药物组OA更明显。PBS对照组骨溶解效应最弱。各组骨溶解面积百分比有明显统计学意义（P<0.05）,t检验分析两药物组间差异明显（P<0.05）。说明PDTC比NAC有更强的骨溶解抑制作用。生理盐水对照组破骨细胞数目ON最多,PBS组ON最少,两药物组ON居中,然而经t检验比较后发现NAC组与PDTC组间差异不显著（P>0.05）。3.2免疫组化染色NF-κBp65表达阳性的IOD（积分光密度）。NF-κBp65的含量越多IOD值越大。分析结果显示:PBS对照组NF-κBp65表达最弱,生理盐水对照组NF-κBp65表达最强。One-wayANOVA分析结果显示四组IOD值之间有统计学差异（P<0.05）。PDTC组比NAC组NF-κBp65表达更弱,说明两种药物对NF-ΚBp65有抑制作用,而且PDTC的抑制作用更强。结论:NF-κB抑制剂对小鼠颅骨骨吸收有抑制作用,从而保护骨组织的完整性。本实验通过Micro-CT扫描,组织切片并HE、TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）、免疫组化染色后分析各项数据,比较两种药物对小鼠颅骨骨吸收的抑制作用,为临床药物治疗关节置换术后骨吸收导致假体松动提供理论依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 NF-ΚB 抑制剂抑制PMMA 颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 应用MCRO-CT 分析药物抑制PMMA 颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解效应的研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢