抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因的改造、表达纯化和性质研究

论文摘要

黄曲霉毒素B1（AflatxoniB1,AFB1）是毒性最强的真菌毒素之一,它具有致畸致癌致突变的三致作用,由于它在花生、玉米等食品中广泛存在,因此严重危害了人们的健康。AFB1是一种半抗原,酶联免疫分析法（ELISA）是检验半抗原的一种快速、简便的分析方法,而该检测方法很大程度上依赖于高质量的抗体。与传统免疫动物法获得的抗体相比,重组抗体技术由于采用微生物表达的方法,获得抗体的周期短,成本低,逐渐成为人们研究的热点。本实验在已经从Tomlinson I+J单链抗体文库中筛选出抗AFB1单链抗体基因H4的基础上对其进行表达,以期获得大量与AFB1结合的单链抗体。通过测序发现H4的前1/5处有一琥珀抑制子TAG,说明即TAG没有起到终止作用而是由于密码子的零星改变而被翻译为谷氨酸。为了保证基因不被提前终止,实验中将TAG突变为编码谷氨酸的GAA,之后通过克隆载体、表达载体的构建,再将表达载体转化表达宿主大肠杆菌BL21 （DE3）和乳酸克鲁维酵母GG799,进行诱导表达和生物活性的鉴定实验。结果表明,突变后的H4即H4-Glu能在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功表达,表达量为25.5 mg/L,其与AFB1的结合活性明显;H4-Glu在乳酸克鲁维酵母中实现了分泌表达,与AFB1有一定的结合活性,但由于获得的是单拷贝整合转化子,表达量不高。对于获得的抗体,测定了游离AFB1对其的半数抑制率IC50及抗体与AFB2,AFG1,AFG2的交叉反应性。AFB1对抗体的IC50为3.77 ng/mL,抗体与AFB2、AFG1、AFG2均有交叉反应,从强到弱依次为AFG1、AFB2、AFG2。实验发现纯化的抗体在4℃可至少存放3个月;冷冻干燥对抗体的活性有影响,可使其活性损失约50%;抗体可以耐受40℃高温,保温4 h后活性仍可残留40%,但不能耐受50℃高温;中偏碱性条件下有利于抗体的活性保存。本实验成功将抗AFB1单链抗体基因H4中的TAG突变为GAA;分别将其在原核表达系统中的大肠杆菌BL21 （DE3）和真核表达系统中的乳酸克鲁维酵母GG799中获得了成功表达,比较而言,大肠杆菌表达系统更适合于表达抗AFB1单链抗体基因,为AFB1的检测奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 黄曲霉毒素的介绍
• 1.2 黄曲霉毒素的结构、毒性和致癌性
• 1.3 黄曲霉毒素的检测
• 1.3.1 薄层色谱法（ TLC ）
• 1.3.2 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.3.3 酶联免疫吸附法（ELISA）
• 1.4 抗体的发展
• 1.4.1 抗体的发展
• 1.4.2 小分子抗体scFv，Fv
• 1.5 噬菌体单链抗体文库
• 1.5.1 噬菌体抗体的筛选
• 1.6 原核及真核表达系统研究进展
• 1.6.1 大肠杆菌表达系统研究进展
• 1.6.2 真核表达系统研究进展
• 1.7 研究的意义和内容
• 1.7.1 研究的意义
• 1.7.2 研究的内容
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 基因、菌株和质粒
• 2.1.2 实验主要仪器
• 2.1.3 实验主要试剂
• 2.1.4 培养基配制
• 2.1.5 溶液的配制
• 2.1.6 所用引物序列
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗黄曲霉毒素B1 单链抗体基因H4 的定点突变
• 2.2.2 BL21（DE3）-pET226-H4-Glu 的构建和诱导表达
• 2.2.4 GG799-pKLAC1-H4-Glu 的构建和诱导表达
• 2.2.5 抗体性质的测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因 H4 的定点突变
• 3.1.1 pUCX05-H4 的验证
• 3.1.2 pUCX05-H4-Glu 的验证
• 3.2 BL21（DE3）-PET228-H4-GLU 的构建和诱导表达
• 3.2.1 pUCX05-H4-Glu（Nco I，Not I）和pET226-H4-Glu 的构建
• 3.2.2 BL21（DE3）-pET226-H4-Glu 诱导表达
• 3.2.3 抗体的特异性鉴定
• 3.2.4 大肠杆菌中抗体的表达量
• 3.3 GG799-PKLAC1-H4-GLU 的构建和诱导表达
• 3.3.1 表达载体pKLAC1-H4-Glu 的验证
• 3.3.2 GG799-pKLAC1-H4-Glu 的构建、验证及单拷贝多拷贝的鉴定
• 3.3.3 GG799-pKLAC1-H4-Glu 的诱导表达
• 3.4 原核和真核表达系统表达抗AFB1 单链抗体的比较
• 3.5 抗体性质的研究
• 3.5.1 包被抗原和单链抗体浓度范围的确定
• 3.5.2 包被抗原和单链抗体最佳工作浓度的确定
• 50 和抗体交叉反应的测定'>3.5.3 半数抑制率IC₅₀和抗体交叉反应的测定
• 3.5.4 冷藏对抗体活性的影响
• 3.5.5 冷冻干燥对抗体活性的影响
• 3.5.6 温度对抗体活性的影响
• 3.5.7 pH 对抗体活性的影响
• 4 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文