论文摘要
microRNA （miRNA,即微小RNA）,是体内22nt的一类非编码的RNA,由miRNA的前体经Dicer酶的作用加工而来。在细胞的生长、增殖、代谢、调亡等方面都有着重要的作用。它可以通过与特定mRNA结合,来调节特定mRNA的蛋白质翻译过程,从而调控基因表达。目前人类基因组中已确认的miRNA有上千个,可能参与30%人类蛋白质的表达调控。随着许多新的miRNA及其功能的不断发现,使得miRNA的研究倍受关注,成为生命科学最热门的研究之一。研究有关miRNA功能的文献有很多,但大部分是在细胞水平的研究,而只在细胞水平研究miRNA功能是远远不够的,因为miRNA功能最终还得在整个机体中发挥作用。在整体水平对miRNA功能的研究,目前国内外都很少。miRNA在胰腺发育和功能的维持中起着非常重要的作用,miR-375是在胰腺中特异表达的miRNA之一,它的正常表达与否对胰腺的形态、发育和功能也至关重要。有关研究表明,miR-375除了对MTPN表达的调控外,还对AdipoR2的表达有调控作用。为了研究miR-375是如何影响胰腺发育和胰腺的功能,探讨miR-375在胰腺发育过程中的作用机理,本实验采用显微注射的方法,利用胰腺内特异表达的启动子RIP（rat insulin premptor）带上编码miR-375的基因,构建miR-375过表达的转基因小鼠模型,旨在研究由miR-375过表达而引起的MTPN、AdipoR2的变化,从而引起胰腺损伤的机理。本研究共分三部分,其主要的实验方法及实验结果如下：第一章miR-375基因的克隆和功能的初步分析本章构建了一个含有miR-375基因序列的质粒pAAV-MCS-miR-375,用pAAV-MCS-miR-375转染Hela细胞48小时后,RT-PCR检测发现转染质粒的Hela细胞有miR-375前体的表达。用pAAV-MCS-miR-375转染Nit-1细胞48小时后,Western Blot检测miR-375过表达对Nit-1细胞中MTPN蛋白表达的调节,结果显示,转染pAAV-MCS-miR-37548小时后的Nit-1细胞中MTPN的表达,与转染pAAV-MCS和未转染的Nit-1细胞中MTPN的表达相比有略微下调。为进一步证实miR-375对MTPN表达的作用,我们用pAAV-MCS-miR-375转染Nit-1细胞48小时后,做免疫细胞化学分析。结果发现,转染pAAV-MCS-miR-37548小时后的Nit-1细胞中MTPN蛋白表达比转染pAAV-MCS和未转染的Nit-1细胞中MTPN蛋白表达下调。本研究还测定了未转染、转染pAAV-MCS-miR-375和转染pAAV-MCS的Nit-1细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌。结果发现转染pAAV-MCS-miR-37548小时后的Nit-1细胞中胰岛素的分泌比未转染和转染pAAV-MCS的Nit-1细胞中胰岛素的分泌下调。这说明我们构建的质粒不但能生成成熟的miR-375,并且能抑制目的Mytrophin基因的表达。本实验成功的克隆了miR-375基因。所构建的表达miR-375的质粒pAAV-MCS-miR-375在细胞中能够表达miR-375、能够抑制MTPN的表达使得细胞受葡萄糖刺激分泌胰岛素的能力下降。第二章转基因小鼠的构建本实验采用显微注射法,利用胰腺内特异表达的启动子RIP（rat insulin premptor）带上编码miR-375的基因和人生长激素基因的Poly（A）,构建miR-375过表达的转基因小鼠模型。通过PCR、Slot Blot、Southern Blot鉴定阳性转基因小鼠。转基因小鼠胰腺中miR-375的表达采用RT-PCR和real-time PCR测定,转基因小鼠胰腺中myotrophin（MTPN）的表达采用real-time PCR和Western Blot测定。结果发现,转基因小鼠胰腺中成熟miR-375的表达是正常小鼠的1.15倍；转基因小鼠胰腺中myotrophin（MTPN）的表达是正常小鼠的1／7.7。转基因小鼠与正常小鼠的体重和血糖测定发现,与正常同类小鼠相比,雌性转基因鼠的体重有明显下降,雄性转基因鼠的体重无变化,转基因鼠的血糖无明显变化。糖耐量实验中雌性转基因鼠在30-60分钟段血糖恢复比正常小鼠快。转基因小鼠空腹血清胰岛素含量用Linco Research公司的RAT/MOUSE INSULIN ELISA KIT测定。结果显示,与正常同类小鼠相比,雌性转基因鼠血清胰岛素含量低34.3%、有显著差异,雄性转基因鼠的血清胰岛素含量无明显变化。在对转基因小鼠进行细胞学检测时,未发现转基因小鼠存在染色体数量或结构上的改变,而RT-PCR检测与胰腺发育相关基因时发现,雌性转基因小鼠县腺中PDX-1、INS1、ISL-1、PAX6、GLK、GLG、PP的表达上升。用胰岛素抗体和胰高血糖素抗体做免疫荧光发现,转基因鼠胰腺中胰岛素和胰高血糖素的合成不受影响。对转基因鼠胰腺做病理切片HE染色发现,在胰腺中胰岛的周围有很多空泡,出现脂肪变性,另外胰腺中的胰岛还显著萎缩。对转基因鼠肺做病理H／E染色发现,肺中有严重的支气管肺炎、支气管坏死和中性淋巴细胞浸润,在支气管中有增生的现象。第三章非β-细胞诱导成产生胰岛素细胞的初步研究本章构建了表达PDX-1、Insulin的质粒pAAV-MCS-PDX-1和pAAV-MCS-Insulin。用pAAV-MCS-PDX-1转入293T细胞后引起了293T细胞中与胰岛发育相关基因的表达或高表达,但是没有胰岛基因的表达。另外还用pAAV-MCS-PDX-1和pAAV-MCS-Insulin共转染293T细胞时发现PDX-1有促进Insulin表达的功能。结果提示293T细胞有被诱导成产生胰岛素细胞的可能。
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