论文摘要
第一部分炎性疼痛大鼠背根神经节miRNA134与MOR1的探索性研究目的作为结合阿片类物质最重要的受体之一，阿片类受体μ1（μ opioid receptor1，MOR1）在痛觉调制和麻醉镇痛过程中参与并起着重要的作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，特定的miRNA如miRNA134已被证实与神经生理功能及疼痛调节关系密切。生物信息学分析发现miRNA134存在与MOR1基因的3’-UTR段相匹配的区域，是MOR1基因调节的可能参与者之一。本研究的目的是探索炎性疼痛大鼠背根神经节内miRNA134与MOR1表达情况及其潜在的相互关系。方法1)选用雄性Wistar大鼠，制备炎性疼痛模型（CFA组），即大鼠右足皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）100μl，相同部位注射等量生理盐水作对照组（NS组）。采用压爪-缩腿法和辐射热-缩腿法来分别测定14天内的机械痛阈（Pressure stimulusthreshold）和热痛阈（Thermal stimulus latency）。2)在4小时，1天，4天，7天，14天五个时间点使用实时荧光定量PCR的方法检测注射侧L3、L4、L5三枚背根神经节内的miRNA134和MOR1mRNA的表达水平。两者表达的相互关系通过线性回归的方法进行统计学分析。3)研究还对注射CFA后4小时、4天、14天炎性疼痛大鼠致痛侧L5背根神经节内MOR1的表达水平通过免疫荧光组织化学的方法进行检测。4)CFA注射4天后大鼠同一背根神经节内miRNA134和MOR1的表达情况也通过原位杂交结合免疫组织化学的方法进行了检测。结果1)行为学结果显示，注射CFA后大鼠右足机械痛阈和热痛阈在1天后明显降低（P＜0.05），分别于3天和4天时降至最低（P＜0.05），持续至注射后第14天（P＜0.05）。CFA注射后大鼠左足机械痛阈及热痛阈与生理盐水组无差别（P＞0.05）。2)实时荧光定量PCR的结果显示：与对照组比较， CFA大鼠背根神经节内miRNA134在1天、4天、7天时低于对照组（P＜0.01），4天后降至最低（P＜0.01）。而MOR1mRNA在4小时，1天，4天，7天，14天五个时间点均高于对照组（P＜0.01），4天后升至最高（P＜0.01）。统计学分析显示两者呈负性相关（R2=0.7363,P＜0.001）。3)免疫荧光组织化学显示： CFA大鼠致痛侧L5背根神经节内MOR1表达明显升高，特别是在注射CFA后4天达到最高。实验结果显示MOR1主要表达在背根神经节小直径神经元内。造模后4小时、4天、14天三个时间点上MOR1阳性细胞所占比例与对照组相比明显升高（P＜0.01），在4天时达到最高（P＜0.05）。荧光浓度结果也显示高于对照组（P＜0.01）。4)原位杂交显示， CFA造模后大鼠致痛侧L5背根神经节内miRNA134降低，而同一背根神经节内免疫组织化学结果显示MOR1表达升高。这种变化主要发生在小直径神经元中。结论CFA造模引起大鼠痛行为发生变化，即痛域下降。同时，炎性疼痛大鼠背根神经节特别是小直径神经元内MOR1及其mRNA表达先升高后降低，而miRNA134则相反，表现为先降低后升高，两者呈现负相关性。背根神经节内的这些变化与痛行为存在关联。结果提示miRNA134作为一种翻译前水平的调节性小RNA，很可能在初级感受神经元水平通过调节MOR1基因表达参与慢性炎性疼痛的调制。第二部分miRNA134在SH-SY5Y细胞系内对MOR1的调节作用研究目的作为表观遗传学的一部分，miRNA可以通过微调基因表达参与机体生理病理功能的调节。通过使用生物信息学程序对MOR1靶基因序列中miRNA134的潜在结合位点的预测，研究发现MOR1与miRNA134具有能量上最有利的杂交位点。对炎性疼痛大鼠在体部分研究显示，炎性疼痛条件下，两者表达呈负性相关。本部分研究的目的是在体外细胞系上观察及验证miRNA134对MOR1表达的调节。方法1)采用脂质体转染的方法，将LNA-anti-miRNA134分10nM、50nM、100nM的浓度转染人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y细胞）。2)48小时后收集细胞提取RNA，使用实时荧光定量PCR的方法检测miRNA134的抑制程度和MOR1mRNA的表达情况。3)同时在转染后72小时收集细胞并提取蛋白，使用蛋白电泳的方法观察MOR1受体蛋白的表达情况。4)实验还采用免疫荧光细胞化学的方法观察转染LNA-anti-miRNA134浓度为100nM时细胞内MOR1的表达情况。5)另外，实验还采用免疫透射电镜的方法在细胞超微水平观察MOR1受体的表达。结果1)将LNA-anti-miRNA134按照低中高三个不同浓度（10nM、50nM、100nM）转染SH-SY5Y细胞系48小时后，实时荧光定量PCR的方法显示与对照组相比，miRNA134表达降低（P＜0.05），MOR1mRNA表达升高（P＜0.01），均具统计学意义。组间比较表明，miRNA134在转染浓度为10nM时开始降低（P＜0.05），100nM时降到最低（P＜0.01）。MOR1mRNA在转染浓度为10nM时已有升高（P＜0.01），在100nM时升至最高（P＜0.01）。两者与转染核苷酸浓度呈现出梯度变化的特点。2)蛋白电泳结果显示，SH-SY5Y转染LNA-anti-miRNA134后72小时， MOR1蛋白与对照组相比，明显升高（P＜0.01）；组间比较显示MOR1受体蛋白在转染浓度为10nM时表达已有升高（P＜0.01），在100nM时升至最高（P＜0.01），MOR1蛋白表达与基因水平表达一致。3)免疫荧光细胞化学结果显示，转染LNA-anti-miRNA134（100nM）72小时后，SH-SY5Y细胞MOR1蛋白表达升高，MOR1阳性细胞所占比例和MOR1免疫荧光浓度也明显增加（P＜0.01）。4)免疫透射电镜从细胞超微水平显示SH-SY5Y细胞转染入LNA-anti-miRNA13（4100nM）后MOR1表达升高，其主要表达部位在细胞表面。结论对SH-SY5Y细胞系转染LNA-anti-miRNA134后，细胞内miRNA134的表达减少，但MOR1mRNA和蛋白的表达增加。这证实了在体外离体细胞模型上miRNA134与MOR1也存在负性调节的关系，这为miRNA134在体内调节MOR1基因表达参与疼痛调制提供了佐证。