论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老年人群中最常见的一种神经退行性疾病,其主要病理特征是β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide,Aβ）在神经细胞外的沉积。探究Aβ生成增多的原因对AD的预防和治疗有重要意义。Aβ是β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein,AβPP）经β-位点AβPP内切酶（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1, BACE1）作用裂解产生的。研究表明,脑胆固醇或脑细胞中胆固醇的增加是引发脑Aβ生成的重要原因。增加神经细胞中的胆固醇能够使BACE1的活性增高,导致Aβ生成增加,相反,降低细胞中的胆固醇,Aβ的生成减少。血胆固醇的改变也能影响脑Aβ的生成。高脂饮食诱导AβPP转基因小鼠产生高胆固醇血症,可使脑Aβ斑块样沉积增加;而给予降胆固醇药物降低血胆固醇后,Aβ含量减少。已知,胆固醇不能通过正常的血脑屏障,那么,非转基因动物的血胆固醇影响脑Aβ生成是否与脑胆固醇有关呢?促黄体生成激素（luteinizing Hormone, LH）是下丘脑-垂体-性腺轴中最重要的激素之一。新近发现,LH在AD患者的血中、脑中的浓度都明显高于同龄的正常人;用LH处理人神经元细胞后,BACE1活性和Aβ的生成均明显增加。已知,LH与性腺的LH受体结合后可调节其中的胆固醇合成增加。大脑也存有LH受体,LH是否也可通过调节脑细胞的胆固醇引起Aβ生成增加?目前尚无报道。为此,本课题分别用高胆固醇饮食增加Wistar大鼠血胆固醇的水平（第一部分）,他汀类药物降低大鼠血胆固醇水平（第二部分）,以及用LH处理神经母细胞瘤M17细胞（第三部分）,导致脑和细胞中Aβ的生成改变后,观察此时脑或细胞中胆固醇的变化,以分析胆固醇在不同因素引起的Aβ生成中的作用。第一部分高胆固醇血症增加脑Aβ的水平但不改变脑胆固醇含量目的:用高脂饮食增加Wistar大鼠血胆固醇的水平,导致脑中Aβ的生成改变后,观察脑胆固醇的变化,探讨脑胆固醇在血胆固醇引起Aβ生成中的作用。方法:成年雄性Wistar大鼠共18只,随机分为普通饮食组（NC）和高胆固醇饮食组（HCC,含2%胆固醇、10%猪油）,每组9只,饲养13周。血清用于血胆固醇浓度测定;大脑组织用于脑胆固醇测定、总RNA提取和脑Aβ含量测定。结果:1高胆固醇饮食增加了血胆固醇浓度用自动生化分析仪测定血清总胆固醇浓度。高胆固醇饮食组大鼠的血胆固醇水平明显高于普通饮食组（3.15±0.62 mmol/l vs 1.62±0.10 mmol/l,p<0.001）。表明高胆固醇饮食导致了大鼠的高胆固醇血症。2高血胆固醇水平的增加了脑Aβ水平用放免法测定脑Aβ水平。高胆固醇血症大鼠脑Aβ显著高于NC组（315.23±73.06 pg/mg protein vs 266.01±36.41 pg/mg protein,p<0.05）。脑中Aβ的含量与血总胆固醇水平呈显著正相关（r=0.89, r2=0.78, p<0.001）。表明,血总胆固醇的增加使脑Aβ的含量增加。3高血胆固醇不影响脑总胆固醇的含量用胆固醇氧化酶-过氧化物酶法测定脑总胆固醇含量。高胆固醇血症大鼠与NC组相比较,脑中的总胆固醇水平的变化无统计学意义（5.96±1.26 mg/10g vs 6.08±0.51 mg/10g,p>0.05）。表明,血胆固醇的增加不影响脑总胆固醇的含量。4高血胆固醇不影响脑胆固醇代谢相关酶基因mRNA的表达用RT-PCR法测定脑胆固醇代谢相关酶基因mRNA的表达。高胆固醇血症大鼠与NC组相比较,脑中胆固醇合成的关键酶HMG CoA还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR）mRNA（0.58±0.05 vs 0.54±0.03,p>0.05）和参与脑胆固醇转化的24S-羟化酶（cholesterol 24-hydroxylase, CYP46）mRNA（0.57±0.01 vs 0.61±0.02,p>0.05）的表达水平的变化无统计学意义。表明,血胆固醇的增加不影响脑胆固醇代谢相关酶基因mRNA的表达,从而进一步证明血胆固醇的增加不影响脑总胆固醇水平。小结:1脑Aβ的水平随血胆固醇的增加呈正相关改变。2血胆固醇增高使脑Aβ水平增加是脑胆固醇非依赖性的。第二部分血胆固醇的降低减少脑Aβ的水平但不改变脑胆固醇含量目的:用他汀药物降低Wistar大鼠血胆固醇的水平,导致脑中Aβ的生成改变后,观察脑胆固醇的变化,探讨脑胆固醇在血胆固醇引起Aβ生成中的作用。方法:成年雄性Wistar大鼠共20只,随机分为对照组（Con）和氟伐他汀灌胃组（FV）,每组10只,氟伐他汀溶于1%羧甲基纤维素溶液中制成混悬液,按20mg/kg/day的剂量灌胃,对照组给予同等剂量1%羧甲基纤维素溶液,连续灌胃28天。血清用于血胆固醇浓度测定;大脑组织用于脑胆固醇测定、总RNA提取、脑Aβ含量测定和AβPP的免疫组化分析。结果:1氟伐他汀降低了血总胆固醇浓度用自动生化分析仪测定血清总胆固醇浓度。氟伐他汀灌胃的大鼠,血胆固醇水平明显低于正常组大鼠（1.13±0.10 mmol/l vs 1.53±0.13 mmol/l,p<0.05）。表明氟伐他汀明显降低了大鼠血胆固醇的水平。2血胆固醇的降低减少了脑Aβ用放免法测定脑Aβ水平。氟伐他汀处理的大鼠脑Aβ水平明显低于对照大鼠组（142.53±27.48 pg/mg protein vs 213.36±45.21 pg/mg protein,p<0.05）。脑中Aβ的含量与血总胆固醇水平呈显著正相关（r=0.54, r2=0.24, p<0.05）。表明,血总胆固醇的改变可影响脑Aβ的含量。3血胆固醇的降低不影响脑总胆固醇的含量用胆固醇氧化酶-过氧化物酶法测定脑总胆固醇含量。氟伐他汀处理大鼠与Con组相比较,脑中的总胆固醇水平的变化无统计学意义（6.32±0.97 vs 6.00±0.58,p>0.05）。表明,血胆固醇的降低不影响脑总胆固醇的含量。4血胆固醇的降低不影响脑胆固醇代谢相关酶基因mRNA的表达用RT-PCR法测定脑胆固醇代谢相关酶基因mRNA的表达。氟伐他汀处理大鼠与Con组相比较,脑中HMGR（0.57±0.05 vs 0.53±0.05,p>0.05）和CYP46 mRNA（0.88±0.06 vs 0.99±0.12,p>0.05）表达水平的变化无统计学意义。表明,血胆固醇的降低不影响脑胆固醇代谢相关酶基因mRNA的表达,从而进一步证明血胆固醇的降低不影响脑总胆固醇水平。5血胆固醇的降低影响了脑Aβ代谢相关基因mRNA和蛋白的表达用免疫组化法分析脑AβPP的表达,用RT-PCR法测定脑Aβ代谢相关基因蛋白和mRNA的表达。氟伐他汀处理大鼠,与正常大鼠相比,脑BACE1 mRNA的水平（0.15±0.02 vs 0.30±0.06,p<0.01）,大脑皮质和海马中AβPP的蛋白表达明显降低;相反,AβPP裂解途径中不产生Aβ的酶α-分泌酶（ Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10 ,ADAM10）mRNA的表达增加（0.34±0.05 vs 0.23±0.05,p<0.01）。表明,血胆固醇降低引起的脑Aβ降低与Aβ生成相关基因表达的改变有关。小结:1脑Aβ的水平随血胆固醇浓度的降低呈正相关改变。2血胆固醇降低减少脑Aβ的生成是脑胆固醇非依赖性的。第三部分LH增加神经细胞Aβ的生成也增加胆固醇的生成目的:用LH处理神经母细胞瘤M17细胞,导致细胞中Aβ的生成改变后,观察细胞中胆固醇的变化,探讨胆固醇在LH引起的Aβ生成中的作用。方法:用LH处理神经母细胞瘤M17细胞5天,收集细胞培养液用于培养液中Aβ含量的测定;收集细胞用于Aβ含量、胆固醇含量、以及胆固醇合成、Aβ生成相关基因的mRNA的测定。结果:1 LH可使M17细胞及培养液的Aβ增加Aβ放免法检测结果显示,不同剂量的LH处理细胞后,细胞培养基中分泌型的Aβ（0mIU/ml,9.78±0.22;20mIU/ml,10.48±0.11,p<0.01;40mIU/ml,11.02±0.20,p<0.001;80mIU/ml,11.61±0.28,p<0.001）和细胞中的Aβ（0mIU/ml,74.02±0.55;20mIU/ml,81.08±3.32,p<0.01;40mIU/ml,85.89±0.63,p<0.001;80mIU/ml,99.06±1.29,p<0.001）含量均明显增多,且呈剂量依赖性。表明LH能促进神经细胞中Aβ的生成。2 LH使细胞中胆固醇含量增加神经细胞中胆固醇的测定结果显示,LH使细胞中胆固醇含量增加,且呈剂量依赖（0mIU/ml,0.29±0.02;20mIU/ml,0.32±0.02,p<0.05;40mIU/ml,0.35±0.07,p<0.05;80mIU/ml,0.39±0.06,p<0.001）;细胞中胆固醇含量与细胞及培养液的总Aβ水平呈正相关。表明,胆固醇有可能在LH促进Aβ生成中发挥作用。3 LH使细胞中胆固醇合成关键酶HMGR的mRNA表达增加Real-time PCR检测结果显示,LH处理后,细胞中HMGR mRNA的表达增高（0mIU/ml,0.04±0.00;40mIU/ml,0.12±0.01,p<0.05）。表明LH处理后,细胞胆固醇含量的增加有可能与HMGR的表达增加有关。4 LH使HMGR的上游调控因子SREBP2的mRNA表达增加Real-time PCR检测结果显示,L?H处理后,SREBP2的mRNA表达增加（0mIU/ml,0.11±0.01;40mIU/ml,0.38±0.04,p<0.01）。表明LH处理后,细胞中HMGR的表达增加可能与SREBP2的表达增加有关。5 LH影响M17细胞中Aβ生成相关基因的表达Real-time PCR检测的结果显示,LH处理后,β-分泌酶裂解途径中BACE1的mRNA表达增高（0mIU/ml,0.03±0.00;40mIU/ml,0.04±0.00,p<0.05）,而AβPP（0mIU/ml,0.10±0.00;40mIU/ml,0.11±0.00,p>0.05）和α-分泌酶途径中的ADAM10的mRNA水平没有明显变化（0mIU/ml,0.03±0.00;40mIU/ml,0.02±0.00,p>0.05）。表明LH处理后,Aβ的生成增多与BACE1的mRNA表达增加有关。小结:LH可能通过SREBP2-HMGR-胆固醇途径,促进神经细胞中胆固醇的合成,从而使细胞中Aβ生成增加。结论:1脑Aβ水平可以随血胆固醇的改变而改变,但这种改变是脑胆固醇非依赖性的。2 LH使神经细胞内Aβ增加是胆固醇依赖性的。3引起脑Aβ改变的因素不都与脑胆固醇有关。神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是最常见的小儿颅外实体性恶性肿瘤,由未分化的交感神经细胞组成,恶性程度高,易复发,预后差。NB对化疗药物产生耐药性是导致患儿预后不良的主要原因。探究NB耐药的具体分子机制对NB的治疗有重要的指导意义。肿瘤抑制因子p53在抑制肿瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡方面发挥核心作用。细胞受到如化疗药物等外界因素刺激时,p53被活化,转录与凋亡相关基因的表达使细胞凋亡,达到抑制肿瘤的目的。p53基因突变或活性丧失都可以使肿瘤细胞抗凋亡,从而导致细胞耐药。HDM2是p53主要的负性调节分子,通过与p53结合,促进p53的降解或抑制p53的转录活性来抑制p53的功能。HDM2过表达的细胞,其凋亡力降低,但用nutlin-3抑制该细胞的HDM2与p53结合后,细胞的凋亡能力明显恢复。由此推测,HDM2高表达并与p53的结合,很可能是细胞抗凋亡,导致耐药的原因。Noxa是p53的下游基因之一,在广谱抗肿瘤药Doxo（Doxorubicin）诱导的NB细胞的凋亡中发挥重要作用。如果上述推测属实,高表达的HDM2与p53结合后,是通过促进p53降解,还是通过抑制p53/Noxa途径,使NB细胞抗凋亡导致耐药?未见报道。为此,本课题分两部分,以各种NB细胞株为研究对象,首先确定了对Doxo耐药的NB细胞株并观察HDM2和p53在细胞中的表达情况,然后,在Doxo-耐药的NB细胞中敲低HDM2的表达,在Doxo-敏感的NB细胞中过表达HDM2,观察HDM2与p53的相互作用,探讨了高表达的HDM2与细胞抗凋亡,耐药的关系,为阐明NB细胞耐药的分子机制及寻找新的NB的治疗靶点提供实验依据。第一部分HDM2与神经母细胞瘤耐药的关系研究目的:确定对Doxo耐药的NB细胞株,观察HDM2在耐药细胞中的表达情况,并通过在Doxo-耐药的NB细胞中敲低HDM2的表达,在Doxo-敏感的NB细胞中过表达HDM2等手段,观察细胞的凋亡情况,探讨高表达的HDM2与细胞抗凋亡,产生耐药的关系;确定Doxo-耐药细胞中HDM2与p53的结合情况;用MG132抑制蛋白酶体降解蛋白的作用,观察p53是否被降解,探讨HDM2是否通过促进p53降解,使细胞抗凋亡而产生耐药。方法:分别给予野生型p53的NB细胞株SK-N-SH,NB-9,NB-19和IMR-32细胞0.1μg/ml Doxo处理24小时,进行细胞毒性检测,确定Doxo-耐药的NB细胞株;用western blot和RT-PCR技术检测不同NB细胞中HDM2和p53的表达;用表达人全长HDM2的慢病毒感染Doxo-敏感的SK-N-SH细胞,使HDM2在细胞中稳定过表达,用0.1μg/ml Doxo处理24小时,sub G0/G1检测细胞的凋亡情况;用siRNA敲低野生型p53且Doxo-耐药的IMR32和NB-19细胞以及p53突变的SK-N-DZ细胞中HDM2的表达,0.1μg/ml Doxo处理24小时,DAPI染色后进行凋亡形态分析;对Doxo-耐药的IMR32和NB-19细胞进行HDM2与p53的免疫共沉淀;分别给予Doxo-耐药的NB-19细胞,Doxo-敏感的SK-N-SH细胞和HDM2稳定过表达的SK-N-SH（即SK1）细胞MG132处理24小时,western blot检测细胞中p53的蛋白量。结果:1 IMR32和NB-19为Doxo-耐药的NB细胞株Doxo处理后,SK-N-SH和NB-9细胞出现明显死亡,而IMR32和NB-19细胞死亡不明显。表明SK-N-SH和NB-9为Doxo-敏感细胞株,而IMR32和NB-19为Doxo-耐药细胞株。2 HDM2在Doxo-耐药NB细胞中高表达Doxo-耐药的IMR32和NB-19细胞中,HDM2 mRNA和蛋白水平均明显高于Doxo-敏感的SK-N-SH和NB-9细胞。表明HDM2在Doxo-耐药NB细胞中高表达。3 HDM2的过表达能够使Doxo-敏感的NB细胞抗凋亡过表达外源性HDM2的Doxo-敏感细胞（SK1,SK2和SK3细胞）被Doxo处理后,其凋亡率明显低于未过表达HDM2的Doxo-敏感细胞（SK-N-SH细胞）。表明,HDM2的过表达可以使Doxo-敏感的NB细胞抗凋亡。4 HDM2的表达降低能够使Doxo-耐药的NB细胞凋亡敲低HDM2的Doxo-耐药细胞（IMR32和NB-19细胞）经Doxo处理后,其凋亡率明显高于HDM2未敲低的Doxo-耐药细胞（IMR32和NB-19）。表明HDM2的表达降低可使Doxo-耐药的NB细胞发生凋亡。5 p53在Doxo-耐药的NB细胞中高表达在Doxo-耐药的IMR32和NB-19细胞中,p53的mRNA和蛋白水平均明显高于Doxo-敏感的SK-N-SH和NB-9细胞。表明,HDM2高表达的Doxo-耐药细胞,其p53也高表达。6高表达的HDM2导致细胞耐药是p53依赖性的敲低HDM2的p53野生型Doxo-耐药细胞（IMR32和NB-19细胞）经Doxo处理后,其细胞凋亡率明显高于未敲低HDM2的Doxo-耐药细胞（IMR32和NB-19细胞）;而p53突变的SK-N-DZ细胞,其凋亡率并没有因HDM2的敲低而增加。表明,HDM2表达降低使Doxo-耐药的NB细胞发生凋亡的过程是p53依赖的。7 HDM2在Doxo-耐药NB细胞中与p53相互结合在Doxo-耐药的IMR32和NB-19细胞中,用p53的抗体进行免疫沉淀时,在沉淀中检测到了HDM2的存在;而用HDM2的抗体进行免疫沉淀时,也能够在沉淀中检测到p53的存在。表明Doxo-耐药细胞中的p53确实是与HDM2相互结合存在的。8 Doxo-耐药的NB细胞中,p53通过蛋白酶体的降解受到了抑制在Doxo-耐药的NB-19细胞中,给予蛋白酶体的抑制剂MG132处理后,p53的蛋白水平并没有随MG132的加入而增加。表明Doxo-耐药的NB细胞中,p53并不通过蛋白酶体而降解。9 Doxo-敏感的NB细胞中,p53可通过蛋白酶体降解在Doxo-敏感的SK-N-SH细胞中,给予蛋白酶体的抑制剂MG132处理后,p53的蛋白含量随MG132剂量的增加而增加。表明,Doxo-敏感的NB细胞中,p53可通过蛋白酶体而降解。10过表达HDM2能够抑制Doxo-敏感的NB细胞p53经蛋白酶体的降解。未转染HDM2的Doxo-敏感细胞（SK-N-SH细胞）,给予蛋白酶体的抑制剂MG132处理后,p53的蛋白含量随MG132剂量的增加而增加;而HDM2过表达后,Doxo-敏感细胞（SK1细胞）的p53蛋白含量却不随MG132的剂量增加而增加。表明,Doxo-敏感的NB细胞过表达HDM2能够抑制p53经蛋白酶体途径的降解。小结:1野生型p53的Doxo-耐药NB细胞,通过高表达的HDM2与p53相互作用,继而抗凋亡,产生耐药。2野生型p53的Doxo-耐药NB细胞中,高表达的HDM2对p53的负性调节作用,与蛋白酶体的降解无关。第二部分HDM2的高表达导致神经母细胞瘤耐药的分子机制目的:探讨HDM2抑制p53转录活性致NB细胞耐药的机制。方法:用siRNA敲低野生型p53且Doxo-耐药的IMR32和NB-19细胞以及p53突变的SK-N-DZ细胞中HDM2的表达,0.1μg/ml Doxo处理细胞24小时,western blot和RT-PCR检测细胞中HDM2和Noxa的表达;用表达人HDM2全长的慢病毒感染Doxo-敏感的SK-N-SH细胞,使HDM2在细胞中稳定过表达,0.1μg/ml Doxo处理24小时后,RT-PCR检测细胞中p53下游基因Noxa和p21的表达,western blot检测细胞中p53,磷酸化p53,Noxa和p21的表达,ChIP和双荧光素酶检测p53与Noxa上游p53顺式作用元件的结合能力。结果:1 HDM2的过表达抑制了Doxo-敏感NB细胞中p53的活化Doxo处理后,Doxo-敏感的NB细胞（SK-N-SH细胞）中,p53的蛋白量、p53的磷酸化程度、以及p53下游基因p21和Noxa的mRNA和蛋白表达均被加强;而HDM2过表达的Doxo-敏感NB细胞（SK1,SK2和SK3细胞）中,p53的蛋白量、p53的磷酸化程度,以及p53下游基因p21和Noxa的表达均没有明显变化。表明HDM2的过表达能够使Doxo-敏感细胞中p53的活化受到抑制。2 HDM2的敲降增加了Doxo-耐药NB细胞中Noxa的诱导表达Doxo处理后,与未敲低HDM2的Doxo-耐药NB细胞（IMR32和NB-19细胞）相比,HDM2敲低细胞中,p53下游基因Noxa的mRNA和蛋白的表达水平均明显增加。表明HDM2的敲降使Doxo-耐药NB细胞中Noxa的表达增加。3 HDM2的过表达抑制了Doxo-敏感NB细胞Noxa的诱导表达Doxo处理后,Doxo-敏感细胞（SK-N-SH细胞）中,Noxa mRNA的表达增加,而过表达HDM2的Doxo-敏感细胞（SK1细胞）中,Noxa的mRNA表达没有改变。表明HDM2的过表达能够抑制Noxa的诱导表达。4在Doxo-耐药的NB细胞中,p53转录活性被HDM2所抑制Doxo处理后,与未敲低HDM2的p53野生型Doxo-耐药NB细胞（IMR32和NB-19细胞）相比,HDM2敲低细胞中,其p53下游基因Noxa的mRNA和蛋白的表达水平均明显增加;而在p53突变的NB细胞SK-N-DZ中,HDM2敲低后,Noxa的蛋白表达没有增加。表明,Doxo-耐药细胞中的p53转录活性被HDM2所抑制。5 HDM2的过表达抑制了Doxo-敏感NB细胞中p53与Noxa上游p53顺式作用元件的结合Doxo处理后,Doxo-敏感NB细胞（SK-N-SH细胞）的p53能够与Noxa上游的p53顺式作用元件结合;而HDM2过表达的Doxo-敏感细胞（SK1细胞）中,p53与其顺式作用元件的结合受到了抑制。表明HDM2的过表达能够抑制Doxo-敏感的NB细胞中p53与Noxa上游p53顺式作用元件的结合。小结:高表达的HDM2通过与p53结合,抑制p53的转录活性,下调其下游的凋亡基因表达,导致p53野生型NB细胞抗凋亡,产生耐药性。结论:高表达的HDM2通过抑制p53的转录活性,下调其下游基因Noxa的表达引起细胞抗凋亡,是p53野生型NB耐药的分子机制。