本文主要研究内容
作者文茂羽（2019）在《BmFoxO在家蚕（Bombyx mori）应对高温胁迫损伤中的功能研究》一文中研究指出：任何生物都是在一定的温度范围内活动,温度是对生物影响最为明显的环境因素之一。温度能影响生物的生活状态、栖息分布、性别决定、生长发育以及存活。极端温度会造成生物体的损伤,如高温会使生物机体处于应激状态,发生代谢功能紊乱,活性氧异常且迅速增多,损伤细胞中核酸、脂质以及蛋白质,导致机体内氧化还原失衡,发生氧化应激反应,破坏正常的生理功能。因此高温是引发生物体氧化应激的最常见的原因。生物体内的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）等,维持着体内氧化平衡,而这些酶会受到相应基因的调控。FoxO是Forkhead转录因子家族中的成员,广泛存在于各种真核生物中,参与多种生物学功能包括抗氧化应激、凋亡和自噬、DNA损伤与修复、细胞周期以及能量代谢。已有研究报道哺乳动物FoxO家族中FoxO3a通过调控锰超氧化物歧化酶（MnSOD）来清除细胞内ROS从而降低细胞氧化损伤,表明FoxO参与了哺乳动物中的氧化应激调控。家蚕是历史悠久的经济动物,为中华民族经济发展和丝绸文化传播做出了卓越贡献。以“框架图、精细图和遗传变异图”为标志的家蚕基因组计划“三部曲”的完成,推动了家蚕转基因等功能基因研究与应用关键技术平台的建立。家蚕属于鳞翅目模式昆虫且是变温动物,外界的温度变化对家蚕生长发育起着关键性作用。高温处理导致家蚕存活率降低,这与体内的ROS增多有关。我国养蚕主要在南方高温地区较多,研究家蚕的抗高温机制以及培育抗高温品种对于养蚕业的发展具有较重要的意义。然而在家蚕中BmFoxO是否参与调控高温胁迫产生的氧化应激以及如何调控尚未见报道,因此本研究首先明确家蚕受到高温或者H2O2氧化胁迫后的分子变化以及造成的损伤情况,通过在BmE细胞过量表达BmFoxO来探究其对高温及氧化应激的影响,最后以BmE细胞作为对象,阐述BmFoxO调控家蚕氧化应激的分子机制。主要研究结果如下:1.家蚕响应高温以及H2O2诱导的氧化应激用37℃高温处理家蚕,与对照25℃相比,脂肪体中ROS含量逐渐升高,利用荧光定量PCR技术检测家蚕脂肪体氧化应激相关基因表达水平,结果显示在高温胁迫处理一定时间内BmFoxO以及抗氧化酶相关基因BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCAT以及BmGADD45基因均出现上调表达,而抗氧化酶BmGpx下调表达。利用生理生化试剂盒检测结果显示SOD和CAT酶活呈现先升高后降低的趋势。在H2O2胁迫处理一定时间内BmFoxO及抗氧化酶相关基因出现与高温处理一致的变化趋势。利用生理生化试剂盒检测结果显示ROS含量逐渐升高,而SOD和CAT酶活也出现与高温处理一致的变化趋势。以上结果表明高温或者H2O2会诱导家蚕氧化应激反应,且会使BmFoxO发生上调表达。2.在BmE细胞胞中中BmFoxO抵抗抗氧氧化化应应激激损损伤伤为了探索其高温或者H2O2诱导氧化损伤的机制,我们首先在BmE细胞中验证高温或者H2O2造成氧化损伤并在细胞上探索其机制。首先使用CCK-8试剂盒检测BmE细胞在37℃处理0、12、24和48 h后的活力变化,结果显示细胞活力随处理时间延长逐渐降低,并且用DCFH-DA探针检测显示细胞在37℃处理12 h后ROS含量明显增多。荧光定量PCR结果显示细胞受到高温诱导后氧化应激相关转录因子和抗氧化酶基因（除BmGpx外）表达量均上调。生理生化试剂盒检测结果表明高温处理后,细胞内SOD和CAT酶活上升,MDA和H2O2含量显著增加。结果表明高温胁迫会诱导BmE细胞氧化应激反应。高温和H2O2在家蚕中造成的氧化损伤趋势一致,为了更好地阐释氧化损伤的分子机制,我们选择H2O2处理进行后续的实验。分别使用终浓度为0、250、500、1000、2000μM的H2O2处理细胞后检测其活力变化,发现在浓度为1000μM以上的H2O2处理细胞后细胞活力出现不可逆下降,同时ROS含量明显增多。随H2O2浓度增加,BmFoxO、BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCAT和BmGADD45基因表达量逐渐升高,与家蚕中的表达变化趋势一致。SOD和CAT酶活和MDA含量持续升高。为了探究BmFoxO在细胞氧化应激中发挥何种功能,构建了BmFoxO过表达载体,并转染进细胞,发现过表达BmFoxO的细胞在高温或H2O2处理后ROS含量相较于对照组明显降低,细胞DNA损伤和死亡率显著降低。以上结果说明高温或者H2O2处理BmE细胞造成的氧化损伤与家蚕中一致,并且过表达BmFoxO能够减少BmE细胞受到氧化应激损伤。3.BmFoxO参与家蚕氧化应激的机制探究FoxO是蛋白激酶B（PKB或者Akt）的主要底物,其活性取决于磷酸化水平。胰岛素和生长因子会使FoxO定位到细胞质最终被降解,而磷酸化的FoxO会定位于细胞核从而调控下游靶基因的表达。为了明确BmFoxO受高温、H2O2处理后的活性影响,我们检测了BmFoxO的亚细胞定位情况,构建了带有EGFP的BmFoxO过表达载体,转染细胞后,发现37℃或H2O2处理都会使BmFoxO的定位从细胞质转移到细胞核,Western blot结果显示细胞受到H2O2胁迫后,BmFoxO大量在细胞核蛋白中被检测到,表明BmFoxO转录活性在高温和氧化应激损伤中增加。在H2O2处理后检测到细胞中Akt的磷酸化水平降低,说明H2O2抑制了Akt蛋白的磷酸化水平。为了探索BmFoxO的转录调控机制,我们对抗氧化酶基因启动子序列进行分析,预测到了Forkhead转录因子的结合基序。为了明确BmFoxO是否直接调控这些基因,设计引物并构建了双荧光素报告载体,双荧光素酶活实验显示BmFoxO能上调SOD1,SOD2,CAT,GADD45这些抗氧化酶基因的启动子活性,而且组成型形式的BmFoxOCA对这些启动子活性的上调效果更为明显。为了进一步确定BmFoxO对抗氧化基因的调控作用,设计了带有生物素标记的探针,EMSA实验表明BmFoxO可以与CRE3探针发生特异性的结合。综上结果表明H2O2通过抑制Akt磷酸化使BmFoxO定位于细胞核,从而增强抗氧化酶基因转录活性,来清除细胞内ROS,降低细胞受到的氧化损伤。
Abstract
ren he sheng wu dou shi zai yi ding de wen du fan wei nei huo dong ,wen du shi dui sheng wu ying xiang zui wei ming xian de huan jing yin su zhi yi 。wen du neng ying xiang sheng wu de sheng huo zhuang tai 、qi xi fen bu 、xing bie jue ding 、sheng chang fa yo yi ji cun huo 。ji duan wen du hui zao cheng sheng wu ti de sun shang ,ru gao wen hui shi sheng wu ji ti chu yu ying ji zhuang tai ,fa sheng dai xie gong neng wen luan ,huo xing yang yi chang ju xun su zeng duo ,sun shang xi bao zhong he suan 、zhi zhi yi ji dan bai zhi ,dao zhi ji ti nei yang hua hai yuan shi heng ,fa sheng yang hua ying ji fan ying ,po huai zheng chang de sheng li gong neng 。yin ci gao wen shi yin fa sheng wu ti yang hua ying ji de zui chang jian de yuan yin 。sheng wu ti nei de kang yang hua mei zhu yao bao gua chao yang hua wu qi hua mei （SOD）、guo yang hua qing mei （CAT）yi ji gu guang gan tai guo yang hua wu mei （Gpx）deng ,wei chi zhao ti nei yang hua ping heng ,er zhe xie mei hui shou dao xiang ying ji yin de diao kong 。FoxOshi Forkheadzhuai lu yin zi jia zu zhong de cheng yuan ,an fan cun zai yu ge chong zhen he sheng wu zhong ,can yu duo chong sheng wu xue gong neng bao gua kang yang hua ying ji 、diao wang he zi shi 、DNAsun shang yu xiu fu 、xi bao zhou ji yi ji neng liang dai xie 。yi you yan jiu bao dao bu ru dong wu FoxOjia zu zhong FoxO3atong guo diao kong meng chao yang hua wu qi hua mei （MnSOD）lai qing chu xi bao nei ROScong er jiang di xi bao yang hua sun shang ,biao ming FoxOcan yu le bu ru dong wu zhong de yang hua ying ji diao kong 。jia can shi li shi you jiu de jing ji dong wu ,wei zhong hua min zu jing ji fa zhan he si chou wen hua chuan bo zuo chu le zhuo yue gong suo 。yi “kuang jia tu 、jing xi tu he wei chuan bian yi tu ”wei biao zhi de jia can ji yin zu ji hua “san bu qu ”de wan cheng ,tui dong le jia can zhuai ji yin deng gong neng ji yin yan jiu yu ying yong guan jian ji shu ping tai de jian li 。jia can shu yu lin chi mu mo shi kun chong ju shi bian wen dong wu ,wai jie de wen du bian hua dui jia can sheng chang fa yo qi zhao guan jian xing zuo yong 。gao wen chu li dao zhi jia can cun huo lv jiang di ,zhe yu ti nei de ROSzeng duo you guan 。wo guo yang can zhu yao zai na fang gao wen de ou jiao duo ,yan jiu jia can de kang gao wen ji zhi yi ji pei yo kang gao wen pin chong dui yu yang can ye de fa zhan ju you jiao chong yao de yi yi 。ran er zai jia can zhong BmFoxOshi fou can yu diao kong gao wen xie pai chan sheng de yang hua ying ji yi ji ru he diao kong shang wei jian bao dao ,yin ci ben yan jiu shou xian ming que jia can shou dao gao wen huo zhe H2O2yang hua xie pai hou de fen zi bian hua yi ji zao cheng de sun shang qing kuang ,tong guo zai BmExi bao guo liang biao da BmFoxOlai tan jiu ji dui gao wen ji yang hua ying ji de ying xiang ,zui hou yi BmExi bao zuo wei dui xiang ,chan shu BmFoxOdiao kong jia can yang hua ying ji de fen zi ji zhi 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :1.jia can xiang ying gao wen yi ji H2O2you dao de yang hua ying ji yong 37℃gao wen chu li jia can ,yu dui zhao 25℃xiang bi ,zhi fang ti zhong ROShan liang zhu jian sheng gao ,li yong ying guang ding liang PCRji shu jian ce jia can zhi fang ti yang hua ying ji xiang guan ji yin biao da shui ping ,jie guo xian shi zai gao wen xie pai chu li yi ding shi jian nei BmFoxOyi ji kang yang hua mei xiang guan ji yin BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCATyi ji BmGADD45ji yin jun chu xian shang diao biao da ,er kang yang hua mei BmGpxxia diao biao da 。li yong sheng li sheng hua shi ji he jian ce jie guo xian shi SODhe CATmei huo cheng xian xian sheng gao hou jiang di de qu shi 。zai H2O2xie pai chu li yi ding shi jian nei BmFoxOji kang yang hua mei xiang guan ji yin chu xian yu gao wen chu li yi zhi de bian hua qu shi 。li yong sheng li sheng hua shi ji he jian ce jie guo xian shi ROShan liang zhu jian sheng gao ,er SODhe CATmei huo ye chu xian yu gao wen chu li yi zhi de bian hua qu shi 。yi shang jie guo biao ming gao wen huo zhe H2O2hui you dao jia can yang hua ying ji fan ying ,ju hui shi BmFoxOfa sheng shang diao biao da 。2.zai BmExi bao bao zhong zhong BmFoxOdi kang kang yang yang hua hua ying ying ji ji sun sun shang shang wei le tan suo ji gao wen huo zhe H2O2you dao yang hua sun shang de ji zhi ,wo men shou xian zai BmExi bao zhong yan zheng gao wen huo zhe H2O2zao cheng yang hua sun shang bing zai xi bao shang tan suo ji ji zhi 。shou xian shi yong CCK-8shi ji he jian ce BmExi bao zai 37℃chu li 0、12、24he 48 hhou de huo li bian hua ,jie guo xian shi xi bao huo li sui chu li shi jian yan chang zhu jian jiang di ,bing ju yong DCFH-DAtan zhen jian ce xian shi xi bao zai 37℃chu li 12 hhou ROShan liang ming xian zeng duo 。ying guang ding liang PCRjie guo xian shi xi bao shou dao gao wen you dao hou yang hua ying ji xiang guan zhuai lu yin zi he kang yang hua mei ji yin （chu BmGpxwai ）biao da liang jun shang diao 。sheng li sheng hua shi ji he jian ce jie guo biao ming gao wen chu li hou ,xi bao nei SODhe CATmei huo shang sheng ,MDAhe H2O2han liang xian zhe zeng jia 。jie guo biao ming gao wen xie pai hui you dao BmExi bao yang hua ying ji fan ying 。gao wen he H2O2zai jia can zhong zao cheng de yang hua sun shang qu shi yi zhi ,wei le geng hao de chan shi yang hua sun shang de fen zi ji zhi ,wo men shua ze H2O2chu li jin hang hou xu de shi yan 。fen bie shi yong zhong nong du wei 0、250、500、1000、2000μMde H2O2chu li xi bao hou jian ce ji huo li bian hua ,fa xian zai nong du wei 1000μMyi shang de H2O2chu li xi bao hou xi bao huo li chu xian bu ke ni xia jiang ,tong shi ROShan liang ming xian zeng duo 。sui H2O2nong du zeng jia ,BmFoxO、BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCAThe BmGADD45ji yin biao da liang zhu jian sheng gao ,yu jia can zhong de biao da bian hua qu shi yi zhi 。SODhe CATmei huo he MDAhan liang chi xu sheng gao 。wei le tan jiu BmFoxOzai xi bao yang hua ying ji zhong fa hui he chong gong neng ,gou jian le BmFoxOguo biao da zai ti ,bing zhuai ran jin xi bao ,fa xian guo biao da BmFoxOde xi bao zai gao wen huo H2O2chu li hou ROShan liang xiang jiao yu dui zhao zu ming xian jiang di ,xi bao DNAsun shang he si wang lv xian zhe jiang di 。yi shang jie guo shui ming gao wen huo zhe H2O2chu li BmExi bao zao cheng de yang hua sun shang yu jia can zhong yi zhi ,bing ju guo biao da BmFoxOneng gou jian shao BmExi bao shou dao yang hua ying ji sun shang 。3.BmFoxOcan yu jia can yang hua ying ji de ji zhi tan jiu FoxOshi dan bai ji mei B（PKBhuo zhe Akt）de zhu yao de wu ,ji huo xing qu jue yu lin suan hua shui ping 。yi dao su he sheng chang yin zi hui shi FoxOding wei dao xi bao zhi zui zhong bei jiang jie ,er lin suan hua de FoxOhui ding wei yu xi bao he cong er diao kong xia you ba ji yin de biao da 。wei le ming que BmFoxOshou gao wen 、H2O2chu li hou de huo xing ying xiang ,wo men jian ce le BmFoxOde ya xi bao ding wei qing kuang ,gou jian le dai you EGFPde BmFoxOguo biao da zai ti ,zhuai ran xi bao hou ,fa xian 37℃huo H2O2chu li dou hui shi BmFoxOde ding wei cong xi bao zhi zhuai yi dao xi bao he ,Western blotjie guo xian shi xi bao shou dao H2O2xie pai hou ,BmFoxOda liang zai xi bao he dan bai zhong bei jian ce dao ,biao ming BmFoxOzhuai lu huo xing zai gao wen he yang hua ying ji sun shang zhong zeng jia 。zai H2O2chu li hou jian ce dao xi bao zhong Aktde lin suan hua shui ping jiang di ,shui ming H2O2yi zhi le Aktdan bai de lin suan hua shui ping 。wei le tan suo BmFoxOde zhuai lu diao kong ji zhi ,wo men dui kang yang hua mei ji yin qi dong zi xu lie jin hang fen xi ,yu ce dao le Forkheadzhuai lu yin zi de jie ge ji xu 。wei le ming que BmFoxOshi fou zhi jie diao kong zhe xie ji yin ,she ji yin wu bing gou jian le shuang ying guang su bao gao zai ti ,shuang ying guang su mei huo shi yan xian shi BmFoxOneng shang diao SOD1,SOD2,CAT,GADD45zhe xie kang yang hua mei ji yin de qi dong zi huo xing ,er ju zu cheng xing xing shi de BmFoxOCAdui zhe xie qi dong zi huo xing de shang diao xiao guo geng wei ming xian 。wei le jin yi bu que ding BmFoxOdui kang yang hua ji yin de diao kong zuo yong ,she ji le dai you sheng wu su biao ji de tan zhen ,EMSAshi yan biao ming BmFoxOke yi yu CRE3tan zhen fa sheng te yi xing de jie ge 。zeng shang jie guo biao ming H2O2tong guo yi zhi Aktlin suan hua shi BmFoxOding wei yu xi bao he ,cong er zeng jiang kang yang hua mei ji yin zhuai lu huo xing ,lai qing chu xi bao nei ROS,jiang di xi bao shou dao de yang hua sun shang 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西南大学的文茂羽，发表于刊物西南大学2019-09-24论文，是一篇关于高温论文,活性氧论文,抗氧化酶论文,家蚕论文,西南大学2019-09-24论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西南大学2019-09-24论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：高温论文; 活性氧论文; 抗氧化酶论文; 家蚕论文; 西南大学2019-09-24论文;