论文摘要
不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi）是一种在人群中携带率很高的病原菌，该菌能够引起急性中耳炎，鼻窦炎，结膜炎，慢性支气管炎的反复发作及恶化等严重感染性疾病，对人类尤其是婴幼儿及老年人的健康威胁极大，因此目前亟待研究一种新型、安全有效的疫苗来预防NTHi的感染。研究证明，在所有流感嗜血杆菌菌株中（含不可分型流感嗜血杆菌）高度保守的外膜蛋白P6（outer membrane protein P6, P6）可以诱导机体产生保护性的体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫，但是天然P6蛋白含量少且提取过程极为繁琐。近年来核酸免疫的发展为我们研制疫苗提供了新的思路，本文就是通过构建真核表达重组质粒pcDNA3.1/His A-P6，并将其免疫动物观察其免疫效果，以确定P6在NTHi疫苗研制中的应用价值。以NTHi全基因组为模板通过PCR扩增获得P6目的基因，构建真核质粒pcDNA3.1/His A-P6，通过菌落PCR、酶切、基因测序的方法确定重组质粒构建成功，并将重组质粒转染至HeLa细胞，以间接免疫荧光蛋白法检测其表达产物；动物实验中，将45只8w龄BALB/c小鼠随机分为3组：PBS组、pcDNA3.1/His A空质粒组、pcDNA3.1/His A-P6重组质粒组，每组每只小鼠分别经股四头肌注射免疫100μL PBS，100μL含100μg pcDNA3.1/His A的PBS，100μL含100μg pcDNA3.1/HisA-P6的PBS，于第0d，14d和28d共进行3次免疫。末次免疫后2w，每组取10只小鼠CCK-8法分析脾淋巴细胞增殖情况；ELISA法分析其脾淋巴细胞IFN-γ和IL-4产生水平；末次免疫后3w，每组其余5只小鼠鼻内接种1×108 CFU/只NTHi，于第3d、7d将100μL PBS灌洗鼻腔检测NTHi清除率；接种NTHi后1w处死小鼠，取其鼻粘膜组织，HE染色法分析鼻粘膜病理变化。成功构建了真核载体pcDNA3.1/His A-P6，经PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为P6蛋白编码基因,而且该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。动物实验中，pcDNA3.1/His A-P6免疫组组小鼠特异性脾淋巴细胞刺激指数及其所产生的IFN-γ水平均高于pcDNA3.1/His A、PBS对照组（P<0.01），而IL-4水平各组无差异；pcDNA3.1/HisA-P6组在NTHi感染后第3d、7d对其清除率分别为80%、90%，显著高于pcDNA3.1/His A、PBS对照组（P<0.01）；HE染色显示目的基因组小鼠鼻粘膜组织结构基本正常，而对照组鼻粘膜紊乱、脱落。该研究成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/His A-P6，将其免疫BALB/c小鼠后可诱导小鼠产生明显的抗NTHi保护效应，提示pcDNA3.1/His A-P6核酸疫苗具有潜在的疫苗研究与开发价值。
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标签：不可分型流感嗜血杆菌论文; 外膜蛋白论文; 核酸疫苗论文; 质粒论文; 免疫论文;