RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响性研究

论文摘要

目的应用RNA干扰技术抑制人survivin基因的表达,观察其对乳腺癌SKBr-3细胞增殖和凋亡的影响。方法根据survivin编码框采用生物信息学,设计2组siRNA相关基因片段和1组阴性对照siRNA片段,序列经BLAST查询,确定为survivin特异性序列,排除与其他基因同源,把所得序列交Sigma生物公司体外合成。应用脂质体转染法将基因转染入乳腺癌SKBr-3细胞,采用MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法分析检测各组细胞在不同时间段的细胞增殖率、RT-PCR和western blot法观察阻断survivin表达后对乳腺癌细胞survivin mRNA和蛋白质表达的抑制率、Annexin V-PE/7-AAD法流式细胞（FCM）检测各组细胞凋亡率。统计学数据处理用均数±标准差（x±s）表示,应用SPSS17统计软件处理数据,多组均数间的比较采用单因素方差分析,然后用SNK进行两两比较,两样本均数的比较采用独立样本的t检验,P<0.05表示有显著性差异。结果取对数生长期的SKBr-3细胞铺板,siRNA通过脂质体转染SKBr-3细胞,在倒置显微镜下观察见：细胞出现明显的细胞皱缩、形态变圆、核分裂相减少、漂浮细胞增多等凋亡改变;MTT法显示2组siRNA对SKBr-3细胞增殖有抑制作用,抑制率明显高于空白对照组及阴性对照组（p<0.01）,且抑制作用具有时间依赖性,其作用最佳时间为转染后48h,其细胞抑制率为（43.1±0.3）%；RT-PCR试验显示2组siRNA组作用于SKBr-3细胞48h后survivin mRNA表达明显下调（p<0.01）,survivin mRNA表达的条带亮度低于其余各组,其mRNA相对表达量分别为：0.203±0.018、0.229±0.019,抑制率分别为55.2%、49.4%。而空白对照组和阴性对照组survivin mRNA水平无明显变化；western blot实验见2组siRNA转染组survivin蛋白表达显著下调（p<0.01）,蛋白条带的灰度低于其余各组,其蛋白相对表达量分别为：0.702±0.007、0.684±0.016,抑制率分别为34.8%、36.4%；于转染48h后收集细胞,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示2组siRNA转染组细胞凋亡率分别为（14.2±1.4）%、（16.8±0.6）%,明显高于其他2组,统计学分析差异有显著性（p<0.01）,而该两组间细胞的增殖与凋亡无明显差别。结论1、本实验针对survivin构建的2组siRNA,确实能有效封闭survivin的表达,抑制SKBr-3细胞增殖并诱导细胞凋亡。一方面提示survivin与乳腺癌的发生、发展、治疗及预后有密切的关系；另一方面提示RNA干扰可用于特异性阻断survivin表达,为靶向诱导乳腺癌细胞凋亡治疗提供了实验依据,为乳腺癌的基因治疗提供了理论基础。2、与survivin mRNA无同源性的阴性对照则对SKBr-3乳腺癌细胞的增殖和凋亡无明显影响,体现了RNAi的特异性优点。3、下调survivin基因的表达来抑制细胞增殖,是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现。4、下调survivin基因的表达,可明显改善肿瘤细胞的异常生物学行为。5、RNAi技术具有高效率、高特异性和显效快等优点,可以作为肿瘤基因治疗的理想技术方法。

论文目录

• 英文縮略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 一、材料
• 1. 细胞系
• 2. 主要试剂
• 3. 主要试剂配制
• 4. 主要仪器
• 二、方法
• 1. 细胞培养及传代
• 2. 细胞计数与存活测试
• 3. siRNA转染
• 3.1 脂质体转染原理
• 3.2 转染步骤
• 4. MTT法检测RNAi后的细胞增殖情况
• 4.1 MTT法原理
• 4.2 MTT法操作步骤
• 4.3 结果处理
• 5. 半定量RT-PCR检测survivin基因mRNA的表达
• 5.1 原理及应用
• 5.2 引物和内参合成
• 5.3 细胞转染及总RNA提取
• 5.4 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 5.5 cDNA合成
• 5.6 PCR反应
• 5.7 凝胶电泳
• 5.8 数据分析
• 6. Western印迹法检测RNAi后survivin蛋白的表达
• 6.1 Western印迹法原理
• 6.2 实验步骤
• 7. Annexin V-PE/7-AAD法流式细胞（FCM）检测凋亡率
• 7.1 Annexin V-PE/7-AAD法流式细胞检测凋亡原理
• 7.2 实验步骤
• 7.3 结果分析
• 8. 统计学处理
• 三、结果
• 1. 细胞形态学观察
• 2. MTT法检测细胞增殖
• 3. RT-PCR检测survivin mRNA表达水平
• 4. 免疫蛋白印记（Western Blot）检测survivin蛋白表达水平
• 5. 转染48小时后siRNA诱导SKBr-3细胞的凋亡率
• 四、讨论
• 五、结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章情况
• 攻读学位期间参与科研情况
• 致谢