猪腮腺分泌蛋白表达特性及表达调控元件的研究

论文题目: 猪腮腺分泌蛋白表达特性及表达调控元件的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 田兴华

导师: 吴常信,李宁

关键词: 腮腺分泌蛋白,唾液淀粉酶,转录起始点,细胞转染,载体构建,启动子,核心启动子,定位,表达特性,定量分析

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 哺乳动物唾液腺是外分泌腺,也兼有部分内分泌功能。大多数分泌物可通过口腔直接到达胃部,在pH>4的情况下发挥作用;少量分泌物可直接进入血液循环发挥作用。唾液蛋白种类繁多,功能多样,往往一种蛋白有数种功能,不同蛋白有相同功能。唾液蛋白的上述特点使其具备了研制生物反应器的条件。腮腺分泌蛋白(Parotid Secretory Protein,PSP)就是一种腮腺特异性表达的蛋白,由于它的功能与免疫相关,引起了人们的关注。为了弄清PSP的表达情况,以及它与α-AMY(α-Amylase)表达的关系,本研究根据已知的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR、荧光定量PCR(fluorescence quantitative Polymerase Chain React,Q-PCR)对猪及小鼠的PSP、AMY在腮腺生后发育不同时期的表达情况进行了研究。结果表明,猪与小鼠的PSP在腮腺生后发育的各时期都是高效表达的,而且PSP的表达量随发育期呈动态变化;并且与AMY的变化方向一致,推测二者存在协同性表达。随后的Northern杂交和Western杂交证实了,PSP在mRNA水平和蛋白水平也是高效表达的。对猪PSP的全长氨基酸序列进行了抗原决定簇分析,推测猪PSP有4个抗原决定簇,分别位于PSP蛋白的22-37aa,41-59aa,180-195aa以及C-端。经过比较,按其中之一合成短肽,将短肽与匙孔血蓝蛋白连接,免疫家兔,获得了抗猪PSP抗血清。从蛋白质水平对其表达情况进行了研究。在整个研究过程中,将a-唾液淀粉酶及三磷酸甘油醛脱氢酶的表达情况作为对照。研究发现PSP在猪及小鼠中都呈腮腺特异性高效表达,表达量在不同发育期呈动态变化,且始终高于GAPDH。并且在6周龄小鼠腮腺中发现了一个20KDa的蛋白,能与PSP抗体发生反应。在第二部分中,首先利用RLM-5’RACE进行了猪PSP转录起始位点的定位,结果表明,通过RLM-5’RACE得到的序列比现有的cDNA序列的5’端长39个碱基。分析发现,现有的猪PSP基因的开放阅读框(Open Reading Fragment,ORF)有误,猪ORF的真正起点(ATG)是在现存5’端上游22个碱基处(ATGATGG)。而猪PSP基因的转录起始位点,位于该基因新的ORF起始密码子上游19个碱基处。在随后进行的PSP核心启动子预测中,分析发现猪PSP基因的启动子属于非典型启动子,不具有TATA box等经典元件;但有8个Inr在转录起始点附近,而且其中两个Inr刚好覆盖在转录起始位点上,这佐证了5’RACE结果,并且与Inr本身的特点也有很好的符合。随后用瞬时转染法对功能性启动子进行定位。首先成功地将普通转染载体改造为启动子分析专用载体。利用一系列嵌套引物对启动子区片段进行了扩增、克隆、亚克隆,成功构建了含有不同长度5’调控区的细胞转染载体。我们利用人唾液腺癌细胞系(Acc-M)作为转染平台,我们培养了猪腮腺原代上皮细胞,将其作为Acc-M的对照和补充。我们拟用质脂体转染法将外源基因导入哺乳动物细胞,为此,我们对不同培养基配方进行摸索,确定了最佳的转染条件。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

缩略词语表

第一章文献综述

第一节腮腺分泌蛋白的相关研究

1.唾液腺的组织结构

2.唾液的成分及功能

3.在唾液腺开展的相关研究

3.1 癌症研究

3.2 唾液腺介导的基因治疗

3.3 免疫方面

3.4 唾液生物反应器的研究

3.5 生物制药及疾病防治

4.腮腺分泌蛋白的研究进展

4.1 各物种PSP基因的发现

4.2 PSP与其它蛋白的关系

4.3 影响腮腺分泌蛋白表达的因素

4.4 腮腺分泌蛋白的表达调控

第二节真核基因转录调控元件研究的策略与方法

1 基因调控分析的首要步骤

2 转录起始位点的定位

2.1 引物延伸

2.2 Rnase保护

2.3 S1核酸酶分析

2.4 cDNA末端的快速扩增(RACE)

3 启动子的功能性分析

3.1 瞬时转染分析法

3.2 稳定转染分析

3.3 其它方法

4 常用的报告基因

第三节 Q-PCR技术的原理及应用

1.实时荧光定量PCR技术的原理简介

1.1 实时荧光定量PCR技术的相关参数

1.2 荧光定量PCR的探针标记技术

1.3 实时荧光定量PCR技术的参照物

1.4 绝对定量和相对定量

1.5 荧光PCR的特点

2.荧光定量PCR的应用

2.1 基因表达的研究

2.2 免疫组份分析

2.3 基因突变及其多态性

2.4 肿瘤研究

2.5 病原体测定

2.6 单基因病的诊断

2.7 法医学应用

2.8 转基因植物产品检测

2.9 发展趋势及应用前景

第二章腮腺生后发育中PSP及A-AMY的表达

第一节材料与方法

1 试验材料

1.1 实验动物

1.2 主要仪器

1.3 实验用酶

1.4 其它药品及试剂

1.5 试剂的配制

2 实验方法

2.1 组织样的采集

2.2 总RNA的提取

2.3 引物设计

2.4 RT-PCR检测

2.5 定量PCR分析

2.6 Northern杂交

2.7 兔抗猪PSP抗血清的制备

2.8 酶联免疫吸附实验(ELISA)测定抗体效价

2.9 腮腺组织总蛋白的提取及定量

2.10 PAGE胶的制备电泳及考马氏亮蓝染色

第二节结果与分析

1 猪腮腺生后发育中PSP与AMY的表达

1.1 总RNA的提取

1.2 RT-PCR检测PSP、AMY的表达

1.3 荧光定量PCR检测PSP、AMY的表达

1.4 Northern blot检测mRNA丰度

1.5 PSP抗原决定簇分析及抗体效价检测

1.6 WESTERN BLOT检测猪PSP及AMY的表

1.7 SDS-PAGE蛋白表达量的分析

2 小鼠腮腺生后发育中PSP与AMY的表达

2.1 总RNA的提取

2.2 RT-PCR检测基因表达量

2.3 荧光定量PCR检测PSP及AMY的表达

2.4 Northern blot检测mRNA丰度

2.5 Western blot

2.6 SDS-PAGE蛋白表达量的分析

3 猪与小鼠PSP、AMY表达情况比较

第三节小结与讨论

第三章猪PSP转录起始点定位及启动子定位载体构建

第一节材料与方法

1 试验材料

1.1 实验动物

1.2 菌株，细胞系和载体

1.3 主要仪器

1.4 药品及试剂

1.5 试剂的配制

2 实验方法

2.1 5’RACE程序

2.2 pMD-T18载体的连接反应

2.3 感受态细胞的制备、效价的测定及质粒DNA的转化

2.4 重组质粒的快速鉴定Cracking法

2.5 质粒DNA或粘粒DNA的小量制备

2.6 质粒DNA或粘粒DNA的大量制备及纯化(碱裂解法)

2.7 BAC的提取方法(醋酸钾法)

2.8 外源片段的回收

2.9 载体改造接头的设计及预处理

2.10 猪PSP基因启动子片段扩增引物

2.11 组织样的采集

2.12 腮腺组织的培养

2.13 脂质体转染法导入外源基因

第二节结果与分析

1.PSP转录起始位点的定位

1.1 总RNA的提取

1.2 5′RACE确定猪PSP基因转录起始位点

2.启动子定位载体的构建

2.1 质粒pEGFP-N1的改造

2.2 PSP启动子的预测

2.3 启动子定位载体的构建

3 猪原代细胞的培养及转染条件的确定

3.1 猪腮腺原代细胞的培养

3.2 细胞转染条件的确定

第三节小结与讨论

1 关于5′RACE

2 关于Inr元件与TATA box的比较

3 关于载体的构建

第四章结论

主要参考文献

个人简历

致谢

发布时间: 2005-07-18

参考文献

[1].SIRT7基因启动子与其蛋白稳定性的调控机制研究[D]. 张浪玺.北京协和医学院2012
[2].辐射诱导miR-320的表达调控及功能研究[D]. 胡铮.中国人民解放军军事医学科学院2012
[3].人类基因组转录调节模体距离保守性的研究与转录起始位点的预测[D]. 吕军.内蒙古大学2008

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