哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的原核和真核表达

论文摘要

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是海水养殖中常见的革兰氏阴性致病菌,其细胞表面特有的外膜蛋白（outer membrane proteins, Omps）在维持细菌细胞结构稳定、物质交换及细菌的致病过程中起着十分重要的作用,并且部分种类如OmpK等具有良好的免疫原性。弧菌外膜蛋白OmpK是一种宽宿主的噬菌体KVP-40受体,其广泛存在于各种弧菌之中,是弧菌细胞表面一种组成性蛋白,具有与外界广泛接触的机会,很有可能是弧菌的表面抗原之一。根据已发表的哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）外膜蛋白OmpK的基因序列（登录号为AY332563）设计1对特异性引物,以哈维氏弧菌基因组DNA为模板通过PCR的方法扩增获得OmpK成熟肽基因片段,大小约为750bp,构建克隆载体pMD18T-OmpK,测序结果表明,该基因与已发表的哈维弧菌外膜蛋白OmpK基因序列存在99%的同源性,初步表明成功克隆了OmpK成熟肽基因片段,且该序列在GenBank上的登录号为HQ395754。重组质粒pMD18T-OmpK经BamHⅠ和HindⅢ两种限制性内切酶双酶切后回收OmpK基因片段,并将此基因亚克隆至质粒pET30a,转入大肠杆菌BL21 （DE3）感受态细胞中,构建了原核表达工程菌E.coli/pET30a-OmpK,重组菌在IPTG的诱导下以包涵体的方式大量表达重组蛋白,重组蛋白分子量大小约为33kD,包涵体经EDTA、Triton、低浓度尿素等反复洗涤后,溶解至高浓度的尿素中,最后通过透析的方法使重组蛋白复性,复性的重组蛋白免疫新西兰兔制备了兔多抗OmpK血清。以已构建好的表达载体pET30a-OmpK为模板,根据pPIC9K分泌表达载体的特征设计一对特异性引物,通过PCR的方法扩增得成熟肽基因片段,然后连入pPIC9K质粒构建了重组表达载体pPIC9K-OmpK,重组质粒经菌落PCR、质粒双酶切以及测序鉴定,结果表明构建成功。大量抽提重组质粒pPIC9K-OmpK和亲本质粒pPIC9K,经SacⅠ线性化后通过电转的方法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中。重组转化子GS115/pPIC9K-OmpK和GS115/pPIC9K经遗传霉素筛选获得了抗4.0mg/mL G418的高拷贝子；经MM/MD平板鉴定发现转化子大多为Mut+；经菌落PCR鉴定发现目的基因成功整合入毕赤酵母基因组中。阳性转化子在甲醇的诱导作用下分泌表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白分子量约为37KD且被过度糖基化。重组蛋白经Western-Blot鉴定发现其能与原核表达的兔多抗OmpK包涵体血清发生反应,说明重组蛋白成功表达且其免疫原性不受影响。以表达载体pET30a-OmpK为模板,根据pPIC3.5K胞内表达载体的特征设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增得OmpK成熟肽基因片段,然后连入pPIC3.5K质粒构建了穿梭载体pPIC3.5K-OmpK, SakⅠ线性化重组质粒pPIC3.5K-OmpK和亲本质粒pPIC3.5K后以氯化锂法转入毕赤酵母GS115,转化子经遗传霉素筛选抗2.0mg/mL G418的高拷贝子,经MM/MD平板鉴定其表型,随后抽提转化子的基因组DNA,以两对引物对其进行反复鉴定,结果表明成功构建了酵母阳性转化子GS115/pPIC3.5K-OmpK和GS115/pPIC3.5K,阳性转化子经甲醇的诱导后胞内表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白分子量约为28.7KD,经酸洗玻璃珠法发现重组蛋白在胞内以包涵体的方式进行表达,Western-Blot鉴定发现其能与兔多抗OmpK包涵体血清发生反应,表明重组蛋白在胞内成功表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 哈维氏弧菌的概况
• 1.1.1 哈维弧菌的生物学特性
• 1.1.2 哈维氏弧菌的流行病学
• 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 1.2.1 毕赤酵母表达系统的操作流程
• 1.2.2 菌株、载体、启动子
• 1.2.3 外源基因的整合方式与拷贝数
• 1.2.4 表达产物的糖基化
• 1.2.5 外源基因的优化改造
• 1.3 鱼用疫苗的研究进展
• 1.3.1 传统疫苗
• 1.3.2 新型疫苗
• 1.4 本实验的目的与意义
• 第2章 哈维弧菌（Vibrio harveyi）外膜蛋白OmpK基因的克隆
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 分子生物学试剂
• 2.1.3 哈维氏弧菌总DNA的提取及OmpK成熟肽基因的扩增
• 2.1.4 PCR产物的纯化
• 2.1.5 感受态细胞的制备
• 2.1.6 T载体与PCR产物的连接、转化及平板抗生素筛选
• 2.1.7 碱裂解法小量制备重组质粒
• 2.1.8 重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 OmpK成熟肽基因的PCR结果
• 2.2.2 重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定
• 2.3 讨论
• 第3章 OmpK原核表达载体的构建、表达与纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 质粒与菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 质粒pMD18T-OmpK与质粒pET30a的双酶切
• 3.1.4 基因OmpK与质粒pET30a的连接、转化及平板抗生素筛选
• 3.1.5 重组表达载体的双酶切鉴定
• 3.1.6 重组蛋白的诱导表达
• 3.1.7 重组蛋白表达方式的检测
• 3.1.8 重组蛋白的纯化与浓缩
• 3.1.9 重组蛋白浓度的测定及兔多抗血清的制备
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 重组质粒的双酶切鉴定结果
• 3.2.2 重组蛋白的诱导表达及表达方式
• 3.2.3 重组蛋白的纯化结果
• 3.3 讨论
• 第4章 哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的克隆与真核分泌表达
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 质粒和菌株
• 4.1.2 试剂与仪器
• 4.1.3 外膜蛋白OmpK成熟肽基因的克隆
• 4.1.4 重组质粒的单酶切线性化与纯化浓缩
• 4.1.5 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
• 4.1.6 电转化
• 4.1.7 酵母转化子的高拷贝筛选及表型利用鉴定
• 4.1.8 酵母转化子的PCR鉴定
• 4.1.9 阳性转化子的诱导表达
• 4.1.10 表达产物的Western-blot分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 OmpK成熟肽基因的PCR扩增
• 4.2.2 穿梭载体pPIC9K-OmpK的PCR鉴定及双酶切鉴定
• 4.2.3 重组质粒的线性化
• 4.2.4 电转化及表型利用
• 4.2.5 酵母转化子的PCR鉴定
• 4.2.6 重组蛋白诱导表达
• 4.2.7 表达产物的Western-blotting结果
• 4.3 讨论
• 第5章 哈维弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆与真核胞内表达
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料与试剂
• 5.1.2 胞内引物的设计
• 5.1.3 穿梭载体的构建
• 5.1.4 氯化锂转化GS115感受态细胞的制备
• 5.1.5 氯化锂转化
• 5.1.6 酵母转化子的高拷贝筛选及表型利用鉴定
• 5.1.7 酵母转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定
• 5.1.8 阳性转化子的甲醇诱导表达
• 5.1.9 重组蛋白表达方式的检测
• 5.1.10 胞内重组蛋白的Western-blot分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 OmpK成熟肽基因的PCR扩增
• 5.2.2 穿梭载体pPIC3.5K-OmpK的PCR鉴定及双酶切鉴定
• 5.2.3 高拷贝转化子的筛选及表型利用鉴定
• 5.2.4 酵母转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定结果
• 5.2.5 重组蛋白的诱导表达结果
• 5.2.6 重组蛋白的表达方式
• 5.2.7 表达产物的Western-blotting结果
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间发表的论文和参加的学术会议
• 致谢