人多发性骨髓瘤脂肪酸合成酶的表达和作为治疗靶位的分子机制研究

论文摘要

人多发性骨髓瘤（MM）是一种起源于B淋巴细胞的浆细胞异常增生的恶性肿瘤，多发于中老年人，随着我国人口的老龄化其发病率逐年增高。标准剂量化疗对MM缓解率低，因肿瘤细胞产生耐药，缓解后短期内复发率高；虽然大剂量化疗联合造血干细胞移植其完全缓解率可由5％升至50％，但由于大剂量化疗后的耐药残余肿瘤细胞影响预后，其远期效果改善不明显。因此，探索新的人多发性骨髓瘤的治疗策略非常必要。脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，FAS）是一种肿瘤代谢性标志抗原，或称之为一种“代谢癌基因”。肿瘤细胞通过激活这种“代谢癌基因”——肿瘤相关性脂肪酸合成酶的过度表达体现了肿瘤细胞生长优势。本研究分四个部分对人多发性骨髓瘤“代谢癌基因”——脂肪酸合成酶的表达状态和作为治疗靶位的分子机制方面作了研究。一、脂肪酸合成酶在人多发性骨髓瘤中的表达研究用免疫组织化学检测，27例人多发性骨髓瘤骨髓标本中，有19例在骨髓涂片上可见骨髓瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒，为脂肪酸合成酶表达阳性细胞。占检测标本的70.37％，而缺铁性贫血骨髓涂片，脂肪酸合成酶表达阴性；用RT-PCR检测人多发性骨髓瘤细胞系U266，RPMI8226，人多发性骨髓瘤骨髓标本和健康献血员PBMNCs中FAS的表达结果发现，人多发性骨髓瘤细胞系U266，RPMI8226均有FAS mRNA的表达，27例人多发性骨髓瘤骨髓标本，有22例有FAS mRNA表达，占检测标本的81.48％；而健康献血员外周血单个核细胞（PBMNCs）中不表达FAS mRNA；用免疫印迹法（Western Blot）检测人多发性骨髓瘤细胞系，临床多发性骨髓瘤骨髓标本脂肪酸合成酶表达结果发现，人多发性骨髓瘤细胞系U266，RPMI8226均有FAS蛋白水平的表达，27例人多发性骨髓瘤骨髓标本有16例有不同程度的FAS表达，占检测标本数的59.25％。而健康人外周血单个核细胞（PBMNCs）不表达FAS。我们认为高表达脂肪酸合成酶的MM可以作为MM的一种表型（Phenotype），可能是一个非常重要的潜在的治疗靶点，二、脂肪酸合成酶抑制剂浅蓝菌素体外抗人多发性骨髓瘤作用的研究我们以U266骨髓瘤细胞为模型，用MTT法检测了浅蓝菌素在体外对U266细胞的增殖抑制作用，发现20ug／ml终浓度的浅蓝菌素即能明显抑制U266细胞的增殖，并呈剂量依赖性。为进一步了解浅蓝菌素抑制骨髓瘤细胞增殖的机制，我们用流式细胞仪技术进行了细胞凋亡及细胞周期DNA分析，结果表明浅蓝菌素抑制U266细胞增殖的机制是导致了细胞早期凋亡增加，20ug／ml的cerulenin作用于U266细胞12h，细胞早期凋亡率为56.9％，晚期凋亡率为3.2％，24h细胞早期凋亡率为69.3％，晚期凋亡率为17.6％，而对照组为4.3％和1.8％。细胞周期DNA分析发现20ug／ml的cerulenin作用于U266 12h，S期从对照组的9.7％上升至20.3％，24h时S期为29.8％，因此，浅蓝菌素可使U266细胞的细胞周期阻滞在S期，从而减少进入G-M期细胞数，减少细胞有丝分裂，导致细胞发生凋亡。本研究结果提示，脂肪酸合成酶抑制剂在体外可通过促进多发性骨髓瘤细胞凋亡抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖，有望成为我们治疗MM的又一新方法和新途径。三、SuperArray cDNA基因芯片研究浅蓝菌素改变多发性骨髓瘤细胞凋亡相关基因的表达为进一步明确cerulenin引起MM细胞凋亡的分子机制，我们用SuperArraycDNA基因芯片研究了浅蓝菌素改变多发性骨髓瘤细胞凋亡相关基因的表达谱。20ug／ml浅蓝菌素处理U266细胞12h后，与空白组对照，在研究的96个基因中，共有44个细胞凋亡相关基因表达改变较明显，其中表达上调2倍以上的基因41个，包括细胞外凋亡通路中TNF受体和配体家族的多个成员基因DR3DR5，OX40，CD40，HVEM-L，CD30L，4-1BB-L，TNFR2，TNFRSF14表达上调，与其相关的死亡域和死亡效应结构域基因DAPK2，MyD88，CIDE-A，CIDE-B表达上调，对细胞内通路有重要调节作用的Bcl-2家族成员Bcl-w，Bik，Nip3，HRK，MCL-1基因的表达上调，Caspase9基因表达上调达43倍，Apaf1，Caspase3等基因也明显上调：有3个基因TNFB／LT，CD40L，TRAF2表达下调2倍以上。结果标明，浅蓝菌素引起0266细胞的凋亡有死亡受体信号通路和死亡受体非依赖的转导通路共同参与，有多个与凋亡+相关的家族的多个基因成员表达发生了变化，Caspase 9表达的显著上调，说明线粒体途径在凋亡中起了主要作用，TRAF2基因表达的变化提示着细胞核内转录因子参与了浅蓝菌素引起U266细胞的凋亡，其确切机制还有待进一步研究。四、天然药物表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和浅蓝菌素抗人多发性骨髓瘤作用及细胞凋亡相关基因的表达谱的差异性比较绿茶提取物——表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）处理不同的肿瘤细胞系，均显示有较强的抑制肿瘤细胞增殖的效应，有学者认为它的抗肿瘤作用与它有强大的抑制脂肪酸合成酶的功能相关。本部分研究对天然药物EGCG抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖及诱发凋亡作用及机制进行研究，并用SuperArray cDNA基因芯片对EGCG和浅蓝菌素抗人多发性骨髓瘤作用及细胞凋亡相关基因的表达谱进行比较，我们用MTT法检测了EGCG在体外对U266细胞的增殖抑制作用，发现50ug／ml终浓度的EGCG即能明显抑制U266的增殖，并呈剂量依赖性。为进一步了解EGCG抑制骨髓瘤细胞增殖的机制，我们用流式细胞仪技术进行了细胞凋亡及细胞周期DNA分析，结果表明EGCG抑制U266细胞增殖的机制是导致了细胞晚期凋亡增加，而浅蓝菌素处理U266细胞相同时间后，U266细胞的凋亡以早期凋亡为主。SuperArray cDNA基因芯片研究结果发现，U266经EGCG处理后，与凋亡相关的96个基因中共有56个基因发生表达变化，其中有51个基因表达上调2倍以上，有5个基因表达下调2倍以上；在表达上调的基因中浅蓝菌素组和EGCG组均上调的基因有31个，其中26个基因表达幅度相近，而有4个基因上调幅度有较大差异，Caspase 9、Myd88在浅蓝菌素组表达上调水平与EGCG组比较差异在2倍以上，Nip3、Casper（CFLAR）在EGCG组表达上调水平与浅蓝菌素组比较差异在2倍以上；在浅蓝菌素组表达上调而在EGCG组表达无变化的基因有6个，为Bruce、CRADD、DFF40（CAD）、GADD45、MdM2、TNFA；在EGCG组表达上调而在浅蓝菌素组表达无变化的基因有5个，为BAX、4-1BB、Trail、TNFSF-11、TRAF6。研究结果表明，EGCG和浅蓝菌素引起U266细胞凋亡均有死亡受体信号通路和死亡受体非依赖的转导通路共同参与，其中有多个与凋亡相关的家族的多个基因成员表达发生变化，但两者在引起凋亡的时间、强度和分子机制上存在一定差异。小结1．脂肪酸合成酶在人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226、U266中高表达，多数临床标本有不同程度的脂肪酸合成酶表达。2．脂肪酸合成酶抑制剂在体外可抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖，有望成为我们治疗MM的又一新方法和新途径。3．浅蓝菌素引起U266细胞的凋亡有死亡受体信号通路和死亡受体非依赖的转导通路共同参与，线粒体途径在凋亡中起了主要作用，细胞核内转录因子可能参与了浅蓝菌素引起U266细胞的凋亡。4．EGCG和浅蓝菌素引起U266细胞凋亡过程中有多个与凋亡相关的家族的多个基因成员表达发生相似变化，但两者在引起凋亡的时间、强度和分子机制上存在一定差异，EGCG的抗多发性骨髓瘤可能通过脂肪酸合成酶这一靶位，有待进一步研究。5．脂肪酸合成酶抑制剂浅蓝菌素和具有脂肪酸合成酶抑制作用的天然药物有望成为人多发性骨髓瘤的治疗的新方法。

论文目录

• 一、研究论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 脂肪酸合成酶在人多发性骨髓瘤中的表达研究
• 第二部分 脂肪酸合成酶抑制剂体外抗人多发性骨髓瘤作用的研究
• 第三部分 SuperArray cDNA基因芯片研究浅蓝菌素改变多发性骨髓瘤细胞凋亡相关基因的表达
• 第四部分 天然药物表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和浅蓝菌素抗人多发性骨髓瘤作用及细胞凋亡相关基因的表达谱的差异性比较
• 研究总结
• 二、综述 脂肪酸合成酶与肿瘤治疗靶点
• 三、附录