许玉刚朱立华孙秀芬苗艳君山东省聊城市第二人民医院生殖医学科山东临清252600
【摘要】目的：探讨精液优化处理后正常形态精子总数（NMSC）与人工受精周期妊娠率之间的关系。方法：回顾性分析241例共577个人工受精周期，精液经密度梯度离心法处理，形态学分析严格按照WHO(WorldHealthOrganization)人类精液检验与处理实验手册第五版标准，比较分析各分组中精液优化处理前后（NMSC）与人工受精周期妊娠率之间的关系。结果：577周期精液处理后NMSC<0．4×106组与≥0.4×106组比较，周期临床妊娠率分别为9.6％和17.6％，统计学有显著差异(P<0.05)；结论：处理后用于宫腔内人工受精的NMSC对其临床妊娠率有影响：当NMSC≥0.4×106时即可获得较高的临床妊娠率。
【关键词】人工受精正常形态精子总数梯度离心精子形态促排卵周期妊娠率【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2015）-08-016-02
夫精宫腔内人工受精(intrauterineinsemination,IUI),是将精液经体外处理后去除精浆，优选活力佳的精子注入子宫腔内以获得妊娠的助孕技术。对男性不育因素,女性宫颈因素、免疫因素及不明原因的不孕症治疗有较好疗效[1]，但是其较低的临床妊娠率5~15%[2～3]，成为制约此技术进一步发展的原因。
本文旨在研究梯度离心前后NMSC对人工受精妊娠结局的影响，以进一步提高IUI成功率。
1资料与方法
1.1研究对象入选范围：2013年10月～2015年4月于我院生殖医学科行IUI的患者，排除女方不孕因素，选取单纯因男性弱精症导致不孕的临床资料，共入选患者241例577个IUI周期。
1.2方法1.2.1精液分析及处理男方禁欲2-7d，手淫法采集于广口无菌无毒容器中，严格按照WHO人类精液检验与处理实验手册第五版标准进行精液常规分析并记录精液量、精子浓度、活动率、a+b级精子比例。采用密度梯度离心法分离精子，将液化后的精液充分混匀加于平衡好的90%、45%的梯度液（vitrolife）上层，放入离心机300g离心15min后弃上清，加入1mlHTF液后混匀，300g离心10min，弃上清，沉渣加入0.3-0.5mlHTF液，取少量标本进行常规分析并记录备用液的量、精子浓度、活动率、a+b级精子比例，置6%CO2培养箱备用。
1.2.2精子形态学分析精液及人工受精备用液均于清洁的载玻片上，分别均匀涂片两片后待其自然干燥,用改良巴氏染色，干燥后立即显微镜观察，精子形态按照WHO人类精液检验与处理实验手册第五版标准进行严格分析；患者的两张涂片各观察评估至少200个精子，计算两次评估正常精子比例均值和误差，确定误差在可接受的范围之内（95%可信区间），计算两次结果平均值得出正常精子形态率并最终计算得出备用液中的NMSC（使用公式：正常精子形态总数=备用液体积×精子浓度×正常精子形态率）。并对注入宫腔内的NMSC分为<0.4×106组与≥0.4×106组两组进行对比分析。
1.2.3女方IUI术前准备所有入选病历均已排除女方不孕因素，IUI术前均采用自然周期方案：周期第8天起经阴道B超监测卵泡发育,至优势卵泡直径达14mm时开始监测尿黄体生成素(luteinizinghormone,LH)峰,出现LH峰后24～40h左右行IUI。
1.2.4手术方法受者取膀胱截石位，暴露宫颈后,用1ml的注射器与特制的无损伤IUI导管连接,吸取经处理后的精子悬液0.3-0.5ml,将导管轻轻插入子宫颈内口后将精子悬液缓慢注入宫腔,缓慢取出导管，平卧20min。
1.2.5黄体支持：受术者均行黄体支持，于确定排卵日肌注黄体酮40mg/每日，共15日。
1.2.6临床妊娠于IUI后2周检测尿妊娠试验或抽血监测β-HCG，阳性患者于IUI后5周复查B超,检测到孕囊、胎芽及胎心搏动者确定为临床妊娠。
1.3统计学处理采用SPSS11.0统计软件进行数据的统计分析，均数的比较采用配对t检验、方差分析，率的差异性分析采用χ2检验。
2.结果2.1精液优化处理后NMSC<0.4×106和NMSC≥0.4×106患者一般资料比较入选患者女方年龄、不孕年限、卵泡大小、子宫内膜厚度等资料对比，均无显著性差异。（见表1）
3.讨论
近年来,诱发排卵药物的改进、精子优化技术的提高、处理液的更新等,使人工受精的临床应用有了很大的进步。如何提高人人工受精的妊娠率，成为研究的热点，根据前者的研究成果，认为影响人工受精妊娠率的男方主要因素有，精液浓度[4]、正常形态精子比率[5-6]、前向运动精子总数[7]等；女性因素众多，如女性患者年龄、不孕年限、卵泡数目、子宫内膜厚度、HCG日激素水平、BMI[8-9]等因素和人工受精临床妊娠率密切相关。
密度梯度离心法优化提取精子利用活力好的精子在离心时更主动地沿沉淀梯度的方向运动、从而迅速穿过不同密度界面的特点，可以回收较多的活力好的精子，与上游法相比，回收率较高，但是离心法处理后的精子，可能影响精子形态，其DNA损伤率较优处理前还要高，这表明离心法可对精子精子形态、DNA结构造成损伤[10]。
为消除女性年龄、不孕年限、子宫内膜厚度、卵泡个数以及激素水平的影响。本文对研究中的梯度离心后NMSC<0.4×106和NMSC≥0.4×106患者一般资料比较分析，结果两两之间无差异。577周期精液处理后NMSC<0.4×106组与NMSC≥0.4×106组比较，临床妊娠率分别为9.6％和17.6％，统计学有显著差异(P<0.01)；原因分析为具有正常精子形态的精子受精能力较强且处理后精子比处理前精子更接近和卵子受精时的状态。因此处理后用于宫腔内人工受精的NMSC对其临床妊娠率有影响。当NMSC≥0.4×106时即可获得较高的临床妊娠率。对于处理后NMSC<0.4×106的患者应在行IUI3个周期未孕时及早考虑IVF或ICSI等其他辅助生殖技术。
参考文献：【1】Nuojua-HutttunenS,TomasC,BloiguR,eta1.Intrauterineinseminationtreatmentinsubfertility:ananalysisoffactorsaffectingoutcome[J].HumReprod.1999,14(3):698-703．【2】GuvenS,GunalpGS,TekinY.Factorsinfluencingpregnancyratesinintrauterineinseminationcycles.JReprodMed2008;53:257-265.【3】EcochardR,CottinetD,MathieuC,etal.Themeanofspermparametersinsemendonationsfromthesamedonor.Animportantprognosticfactorininsemination.IntJAndrol,1999,22(3):163-72.【4】WainerR,AlbertM,DorionA,eta1.Influenceofthenumberofmotilespermatozoainseminatedandoftheirmorphologyonthesuccessofintrauterineinsemination[J].HumReprod.2004,19(9):2060-2065.【5】HauserR,YogevL,BotchanA,etal.Intrauterineinseminationinmalefactorsubfertility:significanceofspermmotilityandmorphologyassessedbystrictcriteria[J].Andrologia,2001,33:13-17.【6】VanWaartJ,KrugerT.F,LombardC.J,etal.Predictivevalueofnormalspermmorphologyinintrauterineinsemination(IUI):astructuredliteraturereview[J].HumReprodUpdate2001,7(5):495-500.【7】WainerR,AlbertM,DorionA,eta1.Influenceofthenumberofmotilespermatozoainseminatedandoftheirmorphologyonthesuccessofintrauterineinsemination[J].HumReprod.2004,19(9):2060-2065.【8】WiserA,Shalom-PazE,ReinblattSL,eta1.Ovarianstimulationandintrauterineinseminationinwomenaged40yearsormore[J].ReproductiveBiomedicineOnline,2012,24:170-173．【9】FreundlG,GrimmHJ,HofmannN,eta1.Selectivefiltrationofabnormalspermatozoabythecervicalmucus[J].HumanReproduction.1988,3(3):277-280.【10】FukudaM,FukudaK,AndersenCY,eta1．Ovulationjumpingfromthelefttotherightovaryintwosuccessivecyclesmayincreasethechancesofpregnancyduringintrauterineinseminationand/orinvitrofertilizationnaturalcycles[J].FertilSteril.2006;85(2):514-7．