论文摘要
一、携带Lipocalin 2的靶向溶瘤腺病毒和非增殖型腺病毒的构建和鉴定目的:构建携带人Lipocalin 2基因且删除E1B55基因的溶瘤腺病毒和携带Lipocalin 2的非增殖型腺病毒。方法:利用RT-PCR技术获得目的基因lipocalin 2并克隆至pCA13质粒,构建重组质粒pCA13-lipocalin 2。用BglⅡ酶从pCA13-lipocalin 2质粒中酶切出包含CMV启动子及lipocalin 2基因的表达框,将该表达框亚克隆入质粒pZD55,获得重组质粒pZD55-lipocalin 2。之后分别将pZD55-lipocalin 2和pCA13-lipocalin 2与pBHGE3共转染293细胞,同源重组产生携带Lipocalin 2的溶瘤腺病毒（ZD55-lipocalin 2）和非增殖型腺病毒（Ad-lipocalin 2）。采用PCR和wester-blot对构建的病毒从基因和蛋白水平进行鉴定。结果:PCR鉴定病毒DNA显示:ZD55-lipocalin 2保留了E1A区缺失了E1B55序列,而Ad-lipocalin 2缺失E1A序列。以lipocalin 2的CDS区设计的引物可以从构建的病毒DNA中扩增出相应的目的条带;同时用wester-blot可检测到被腺病毒感染的PANC-1细胞能表达Lipocalin 2蛋白。结论:成功构建了携带人Lipocalin 2的靶向溶瘤腺病毒和非复制型腺病毒,为研究其抗胰腺癌作用提供基础。二、ZD55-lipocalin 2诱导细胞凋亡抑制胰腺癌生长的体外实验研究目的:从细胞学水平研究ZD55-lipocalin 2的抗胰腺癌作用及其机制。方法:经不同浓度不同治疗性病毒处理的PANC-1细胞,采用四甲基偶氮哩盐叮（MTT）法检测对细胞的增殖抑制效应。采用Annexin V和PI染色流式检测细胞凋亡。采用wester-blot法,检测凋亡相关基因Caspase-3的蛋白表达,以研究ZD55-lipocalin 2诱导胰腺癌细胞凋亡的机制。结果:ZD55-lipocalin 2抗胰腺癌PANC-1细胞的作用优于单存的病毒（ZD55）或者单存的基因（Ad-lipocalin2）,其抗癌作用具有时间依赖性和浓度依赖性。ZD55-lipocalin 2可通过活化Caspase-3,从而引起胰腺癌细胞的凋亡,其活化Caspase-3的能力也具有浓度和时间依赖性。结论:ZD55-lipocalin 2具有明显的病毒基因的协同抗胰腺癌作用,它可能是通过Caspase依赖的凋亡通路启动胰腺癌细胞的凋亡。三、Lipocalin 2抑制胰腺癌细胞侵袭运动能力的体外实验研究目的:体外探讨Lipocalin 2对胰腺癌细胞的侵袭运动能力的影响。方法:经Ad-lipocalin 2不同处理的PANC-1细胞,采用迁移实验观察lipocalin2对PANC-1细胞运动能力的影响,并采用侵袭实验观察lipocalin 2对PANC-1细胞侵袭能力的影响。结果:迁移实验和侵袭实验均显示在48h内随Ad-lipocalin 2感染滴度的增加,PANC-1细胞能穿越过Transwell小室基底膜的数量不断减少。结论:Lipocalin 2蛋白具有明显的抑制胰腺癌细胞侵袭运动的能力。四、ZD55-lipocalin 2治疗胰腺癌的动物实验研究目的:观察ZD55-lipocalin 2对裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤的疗效。方法:建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型,分为PBS组、ZD55-lipocalin 2治疗组和ZD55-EGFP对照组,各组对应进行瘤内给药。观察肿瘤体积及裸鼠生存情况,并用TUNEL法检测瘤体内的凋亡。结果:治疗组ZD55-lipocalin 2组和ZD55-EGFP组的瘤体体积与PBS组相比均显著缩小（P＜0.05）,并且ZD55-lipocalin 2组瘤体体积缩小明显于ZD55-EGFP组（P＜0.05）。治疗组ZD55-lipocalin 2组和ZD55-EGFP组平均生存期较PBS组显著延长（P＜0.05）;ZD55-lipocalin 2组肿瘤组织内可见到明显的凋亡细胞。结论:ZD55-lipocalin 2对裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤有显著的抑制作用,诱导肿瘤细胞凋亡是它的抗肿瘤机理之一。