白色念珠菌基因CaFSP1的功能研究和CaMCI4基因的敲除

论文摘要

本研究克隆了酿酒酵母ScYMR034c的白色念珠菌同源基因CaFSP1,发现它编码一个411个氨基酸,与ScYMR034c编码的氨基酸序列一致性为57%,相似性为73%。根据DNA同源重组的原理,构建了CaFSP1的缺失菌株,其基因型得到PCR和Southern杂交的证实。表型研究发现CaFSP1基因的缺失导致细胞膜完整性受到破坏,造成白色念珠菌细胞对SDS、NaCl、CaCl2和KCl敏感,对LiCl、H2O2和ZnCl2产生耐受性,对抗真菌药物酮康唑和特比耐芬产生抗药性。此外,CaFSP1基因的缺失促进白色念珠菌在Spider培养基中菌丝的形成,但是局限了菌落向外周浸入生长的能力。引入克隆的CaFSP1基因能够恢复fsp1缺失株所有的表型。我们推测CaFSP1基因与白色念珠菌细胞的固醇和鞘脂的代谢有关,这两个成分对维持细胞膜正常功能和白色念珠菌的形态转化非常重要。我们还对CaFSP1在酵母中的同源基因ScYMR034c的功能进行了研究,发现酵母ymr34c△菌株也对NaCl和KCl敏感,但是CaFSP1不能互补ymr34c△酵母菌株的表型缺陷。我们还构建了酿酒酵母ymr34c△acr3△双基因缺失株,发现ymr34c△acr3△双基因缺失株和ymr34c△单倍体缺失株对酮康唑的敏感性和野生型对照没有差异,而酵母二倍体缺失株acr3△对酮康唑敏感。用同样的策略,我们还敲除了编码白色念珠菌线粒体中非常重要的电子传递载体NADH脱氢酶基因CaMCI4,为进一步研究CaMCI4基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 研究综述
• 1.1 白色念珠菌研究概况
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 白色念珠菌细胞壁的研究
• 1.1.3 白色念珠菌细胞膜的研究
• 1.2 白色念珠菌的耐盐机制研究
• 1.2.1 白色念珠菌细胞膜的完整性与耐盐
• 1.2.2 白色念珠菌对钙离子抗性的研究
• 1.2.3 白色念珠菌对锌离子抗性的研究
• 1.2.4 白色念珠菌对钾离子抗性的研究
• 1.3 抗真菌药物的研究
• 1.3.1 常用抗真菌药物作用途径和作用靶点
• 1.3.2 白色念珠菌对酮康唑的耐受机制
• 1.3.3 白色念珠菌细胞膜和抗药性之间的关系
• 1.3.4 白色念珠菌细胞膜中固醇和鞘脂互相调节
• 1.4 白色念珠菌菌丝形成的调控
• 第二章 CaFSP1 基因的功能研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验所用菌株、引物和质粒
• 2.1.2 实验所用仪器
• 2.1.3 实验所用主要试剂
• 2.1.4 主要溶液
• 2.1.5 实验所用培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌转化及质粒提取
• 2.2.2 DNA 片段的回收纯化
• 2.2.3 PCR 反应
• 2.2.4 酶切体系和连接体系的建立
• 2.2.5 酵母细胞和白色念珠菌细胞的转化
• 2.2.6 提取白色念珠菌的基因组DNA
• 2.2.7 倍比稀释法进行表型实验
• 2.2.8 测定菌株在不同时间点的细胞浓度，制作生长曲线
• 2.2.9 测定不同浓度LiCl 培养不同菌株的细胞浓度
• 2.2.10 试验图像的采集
• 2.2.11 常登陆的网站
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 CaFSP1基因敲除
• 2.3.2 白色念珠菌CaFSP1 基因的克隆
• 2.3.3 白色念珠菌CaFSP1 基因的功能研究
• 2.4 讨论
• 第三章 酵母基因ScYMR34C 的研究
• 3.1 实验材料和方法
• 3.1.1 实验所用质粒、引物和菌株
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果和讨论
• 第四章 白色念珠菌MCI4 基因的敲除
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验所用引物、菌株和质粒
• 4.1.2 实验所用方法
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 MCI4 敲除盒的构建
• 4.3.2 白色念珠菌MCI4 基因的敲除
• 4.3.3 讨论
• 第五章 总结与展望
• 5.1 主要创造性工作总结
• 5.2 相关工作的前景展望
• 第六章 附录
• 2制备感受态细胞制备'>附录1 CaCl₂制备感受态细胞制备
• 附录2 碱裂解法提取质粒
• 附录3 乙酸锂法转化酿酒酵母细胞酵母
• 附录4 白色念珠菌的转化方法（醋酸锂法）
• 附录5 酸性玻璃珠法提取酵母或白色念珠菌DNA
• 附录6 生化名词缩写
• 参考文献
• 致谢