禽腺病毒hexon基因克隆表达及间接ELISA和荧光PCR检测方法的建立

论文摘要

禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属,根据其抗原性的不同可分为3个群,其中Ⅰ群禽腺病毒包含12个血清型。Ⅰ群禽腺病毒含有相同的群抗原,其中比较著名的病毒株有鸡胚致死孤儿病毒、鹌鹑支气管炎病毒、鸡包涵体肝炎病毒。所有年龄的家养禽均为易感,临床和病理症候群包括肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量减少。Ⅰ群禽腺病毒既可水平传播,也可垂直传播。根据GenBank上的CELO病毒六邻体（hexon）基因序列,通过软件比较禽腺病毒hexon氨基酸序列,结合二维结构图提示的多肽暴露情况以及抗原性预测分析,设计并合成了一对特异性引物,对禽腺病毒1型CELO株的hexon主要抗原性多肽片段进行PCR扩增,与PGEX-4T-1原核表达载体连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经0.2mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白分子量为72.24kD,占全菌蛋白的34%。Western-blotting结果表明:原核表达的hexon重组蛋白具有抗原性,能与感染FAV的阳性血清反应。另外,分别用不同浓度的尿素和Triton X-100对hexon重组蛋白进行包涵体纯化,蛋白的终浓度为30μg/mL。经BandScan4.3生物图象分析软件分析蛋白的纯度为85.0%。达到较高的浓度和纯度,说明本试验探索的纯化方法能有效的纯化这些重组蛋白。其次,将纯化的hexon蛋白作为包被用抗原进行间接酶联免疫吸附试验（ELISA）,确定其最佳包被浓度为10μg/mL;一抗稀释度为1:200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1∶5000,重组蛋白不与NDV、AIV、EDSV、ARV阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性。本研究初步建立了能检测FAV抗体的重组蛋白ELISA诊断方法,用这种方法对FAV的12个血清型病毒免疫SPF鸡的血清进行检测,结果表明该方法在FAV抗体检测方面具有较高的敏感性。最后,根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因的保守序列设计了一对引物,建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法。以质粒DNA为标准品,建立了标准曲线及熔解曲线。同时进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,制作的标准曲线中各浓度范围内有较好的线性关系且线性范围宽;与AIV、IBDV等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应,灵敏度达1×102拷贝/μL,表明具有较好的特异性和敏感性;重复性试验结果表明,具有良好的准确性。本方法从病毒核酸提取至检测完成仅需5h左右,操作简便快速,为快速、准确检测Ⅰ群禽腺病毒提供了一种有效的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 禽腺病毒病概况
• 1 禽腺病毒分类
• 2 禽腺病毒形态结构和理化特性
• 3 禽腺病毒基因组结构和主要蛋白
• 4 禽腺病毒的流行病学与致病性
• 第二节 诊断技术的研究进展
• 1 电子显微镜法和包涵体检查
• 2 病毒分离
• 3 血清学检测技术
• 3.1 中和试验
• 3.2 琼脂扩散试验
• 3.3 血凝抑制试验
• 3.4 酶联免疫吸附测定法
• 3.5 分子生物学技术
• 第三节 实时荧光PCR方法研究概况
• 第二章 禽腺病毒1型hexon主要抗原性基因的原核表达及纯化
• 1 材料和方法
• 1.1 病毒、菌种及抗体
• 1.2 主要试剂
• 1.3 病毒DNA的提取
• 1.4 CELO株Hexon主要抗原性基因的PCR扩增
• 1.5 重组表达载体的构建与鉴定
• 1.6 Hexon蛋白的表达及最佳诱导条件的探索
• 1.7 纯化产物的Western-blotting鉴定
• 1.8 Hexon蛋白的提取及纯化
• 1.9 蛋白质浓度、纯度的检测及保存
• 2 结果分析
• 2.1 PCR扩增克隆与鉴定
• 2.2 蛋白的诱导表达
• 2.3 蛋白可溶性分析及Western-blotting检测
• 2.4 重组蛋白的表达及纯化
• 2.5 蛋白质浓度的计算
• 3 分析及讨论
• 第三章 Hexon主要抗原性基因蛋白ELISA检测方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 抗原和菌种
• 1.2 主要试剂
• 1.3 血清的制备
• 1.4 hexon重组蛋白ELISA检测方法的建立
• 1.5 阴、阳临界值的确定
• 1.6 特异性试验
• 1.7 人工感染SPF鸡的敏感性试验
• 1.8 稳定性试验
• 1.9 间接ELISA方法的应用
• 2 结果
• 2.1 间接ELISA诊断方法最佳工作条件的确定
• 2.2 ELISA程序确定
• 2.3 间接ELISA阴、阳性临界值的确定
• 2.4 特异性试验
• 2.5 敏感性试验
• 2.6 重复性试验
• 2.7 间接ELISA方法的应用
• 3 讨论及结论
• 第四章 SYBR Green Ⅰ荧光PCR方法检测Ⅰ群禽腺病毒
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒、菌种和载体
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 引物设计
• 1.4 病毒DNA提取
• 1.5 标准品的制备
• 1.6 核酸浓度及纯度测定
• 1.7 质粒DNA的10倍梯度稀释方法
• 1.8 扩增曲线的建立
• 1.9 标准曲线的建立
• 1.10 敏感性试验
• 1.11 交叉性试验
• 1.12 重复性试验
• 1.13 Ⅰ群禽腺病毒的检测
• 2 结果
• 2.1 hexon P1基因的扩增
• 2.2 重组质粒的PCR鉴定
• 2.3 质粒DNA浓度的测定
• 2.4 标准曲线的建立
• 2.5 敏感性和交叉试验
• 2.6 重复性试验
• 2.7 Ⅰ群禽腺病毒的检测
• 3 分析与讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 研究生期间发表的专业论文