稻瘟病菌中MoRab51假定互作蛋白MoYIP3、MoVPS9的功能分析

论文摘要

Rab蛋白是一类单体形式的GTPase,由200多个氨基酸组成,具有共同的结构特征,包括保守的G结构域与高度可变的N端和C端并且有类似于Ras蛋白的重叠结构,Rab蛋白作为细胞内囊泡运输的分子开关,在囊泡运输过程的不同阶段发挥作用。Rab5是Rab家族蛋白中的一员,它主要定位在早期内涵体上,调控早期内涵体的出芽、融合、囊泡的形成以及受体介导的胞吞过程参与胞内蛋白质等物质的定向运输。本论文是在前期已经明确MoRab51功能的基础上,重点寻找其下游调控侵染致病过程的效应因子并进行功能研究。因此,我们通过生物信息学分析,在稻瘟病菌中获得MoRab51的两个假定互作蛋白MoYIP3和MoVPS9,通过酵母双杂交点对点的方法鉴定它们之间的互作关系；通过同源重组的方法敲除基因并进行后续基因功能分析,从而初步明确两个蛋白在稻瘟病菌中的功能。酵母双杂交实验表明,MoYIP3不与MoRab51互作,而Mo VPS9则与DN状态下的MoRab51互作,初步验证Mo VPS9是MoRab51的GEF （guanine nucleotide exchange factors）。通过生物信息学的方法,对两种蛋白进行了亚细胞定位,并比较其与真菌中同源蛋白的进化关系,结果显示,其对应的结构域高度同源。通过同源重组的方法,获得了MoYIP3和MoVPS9基因的敲除突变体,对基因功能做了相应的表型分析。结果表明,与野生型ku80相比,△MoYIP3突变体的气生菌丝减少、菌落边缘厚度变薄,产孢量下降,但致病性没有降低,说明基因MoYIP3的缺失不会对稻瘟病菌的生长发育及致病机制产生关键性的影响,但该基因在稻瘟菌菌丝形成及产孢途径中发挥其作用。△MoVPS9突变体菌落生长速率明显减慢、气生菌丝减少、菌落边缘厚度变薄、孢子梗数目减少、产孢量显著下降。同时,突变体对外界胁迫的敏感性增强,致病性显著降低,说明基因MoVPS9的缺失对稻瘟菌的生长发育及致病性产生重要的影响。Real-time PCR分析结果表明,MoRab51在MoYIP3的突变体中的表达量与野生型ku80相比是下调的,而MoVPS9的结果则相反,说明MoYIP3和MoVPS9可能参与MoRab51的信号传递途径。综上所述,实验结果有助于了解MoRab51调控稻瘟病菌侵染致病的分子机制,也为进一步从细胞生物学角度阐明该过程的信号网络途径奠定基础。从而全面理解Rab蛋白介导的胞内各类泡囊定向运输的的分子动力学机制,为深入了解该病菌的致病机制并制定合理的防治策略提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 水稻稻瘟病及稻瘟病菌
• 1.1 水稻稻瘟病
• 1.2 稻瘟病菌侵染致病机理
• 2 Rab蛋白家族
• 2.1 Rab家族蛋白的结构
• 2.2 Rab家族蛋白的功能
• 2.2.1 Rab蛋白的囊泡运输功能
• 2.2.2 Rab蛋白的循环
• 3 Rab5的研究进展
• 3.1 Rab5蛋白
• 3.2 Rab5蛋白的分布
• 3.3 Rab5的效应因子
• 3.4 Rab5蛋白的功能
• 4 本研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验菌株和植物
• 1.2 实验质粒
• 1.3 主要化学试剂
• 1.4 实验常用培养基
• 2 实验方法
• 2.1 生物信息分析方法
• 2.2 构建载体
• 2.2.1 制备高效率感受态细胞
• 2.2.2 PCR反应体系
• 2.2.3 PCR产物纯化
• 2.2.4 TA克隆
• 2.2.5 酶切及连接体系
• 2.2.6 细菌转化
• 2.3 稻瘟菌基因组DNA的提取
• 2.4 质粒提取的方法
• 2.5 稻瘟病菌基因组总RNA的提取
• 2.6 稻瘟病菌原生质体的制备
• 2.7 原生质体转化及转化子的筛选
• 2.8 RNA的反转录
• 2.9 Real-time PCR
• 2.10 稻瘟病菌表型分析
• 2.10.1 菌落生长速率测定与菌落颜色观察
• 2.10.2 产孢量测定
• 2.10.3 孢子萌发率和附着胞形成率测定
• 2.10.4 洋葱表皮侵染实验
• 2.10.5 离体接种大麦
• 2.10.6 水稻育苗及接种方法
• 2.10.7 水稻发病调查
• 第三章 结果与分析
• 1 稻瘟病菌中MoRab51假定互作蛋白生物信息学分析
• 1.1 稻瘟病菌中MoRab51假定互作蛋白的获得
• 1.2 稻瘟病菌中MoRab51假定互作蛋白的理化性质分析
• 2 MoRab51假定互作蛋白MoYIP3、MoVPS9与MoRab51的互作关系验证
• 2.1 稻瘟病菌MoRab51负显性失活诱饵载体的构建
• 2.2 pGADT7-MoVPS9和pGADT7-MoYIP3载体的构建及酵母双杂交
• 2.3 酵母双杂交验证实验
• 3 MoRab51假定互作蛋白的MoYIP3、MoVPS9的基因功能分析
• 15244）的功能分析'>3.1 MoYIP3（MGG₁5244）的功能分析
• 3.1.1 MoYIP3的生物信息学分析
• 3.1.1.1 MoYIP3同源蛋白比对及其系统进化树分析
• 3.1.2 MoYIP3敲除突变体的获得及生物功能分析
• 3.1.2.1 MoYIP3同源重组长片段的获得
• 3.1.2.2 MoYIP3敲除突变体的筛选及其验证
• 3.1.2.3 MoYIP3敲除突变体生物功能分析
• 3.1.2.3.1 MoYIP3敲除突变体菌落形态观察
• 3.1.2.3.2 MoYIP3敲除突变体产孢量统计
• 3.1.2.3.3 MoYIP3敲除突变体孢子萌发率和附着胞形成率统计
• 3.2.2.3.4 MoRab51在MoYIP3敲除突变体中的表达量分析
• 3.1.2.3.5 MoYIP3敲除突变体致病性分析
• 05379）的功能分析'>3.2 MoVPS9（MGG₀5379）的功能分析
• 3.2.1 MoVPS9的生物信息学分析
• 3.2.1.1 MoVPS9同源蛋白比对及其系统进化树分析
• 3.2.2 MoVPS9敲除突变体的获得及生物功能分析
• 3.2.2.2 MoVPS9敲除突变体的筛选及验证
• 3.2.2.3 Mo VPS9敲除突变体生物功能分析
• 3.2.2.3.1 MoVPS9敲除突变体菌落形态观察
• 3.2.2.3.2 MoVPS9敲除突变体产孢量统计
• 3.2.2.3.3 Mo VPS9敲除突变体分生孢子梗观察
• 3.2.2.3.4 MoVPS9敲除突变体分生孢子形态观察
• 3.2.2.3.5 MoRab51在MoVPS9敲除突变体中的表达量分析
• 3.2.2.3.6 Mo VPS9敲除突变体细胞壁敏感性分析
• 3.2.2.3.7 Mo VPS9敲除突变体致病性分析
• 第四章 讨论与小结
• 4.1 MoYIP3、MoVPS9与MoRab51的互作关系
• 4.2 MoYIP3生物功能的讨论
• 4.3 MoVPS9生物功能的讨论
• 4.4 浅谈MoVPS9的CUE结构域
• 参考文献
• 附录
• 致谢