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Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对SMMC-7721细胞凋亡及其相关机制的研究

2020-12-07阅读(636)

Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对SMMC-7721细胞凋亡及其相关机制的研究

论文摘要

Smac是继细胞色素c（cytochrome c,Cyt c）后发现的又一种线粒体促凋亡蛋白,其过表达能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。本研究主要探讨Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对人肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响及其相关机制。本实验构建了携带Smac基因的重组质粒pcDNA3.1+-FL hSmac,转染SMMC-7721细胞后可有效表达Smac mRNA和蛋白;建立了稳定过表达Smac基因的细胞株SMMC-7721/Smac。以SMMC-7721细胞为模型,采用MTT法检测瞬时Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对细胞增殖的抑制作用,AO/EB法和AnnexinⅤ/PI双荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡,采用Western blot法检测细胞中caspase-3、-9和Cyt c蛋白表达的变化,并以SMMC-7721/Smac细胞为模型,采用Western blot法和免疫细胞化学法检测联合顺铂/氯化镉后细胞中这三种蛋白表达的变化。研究结果表明,瞬时Smac基因过表达可抑制细胞增殖,诱发细胞凋亡,且可明显增强顺铂/氯化镉对肝癌细胞的增殖抑制和促凋亡作用,加速细胞由早期凋亡向晚期凋亡的进程。瞬时Smac基因过表达可增加细胞中caspase-3、-9和Cyt c的表达,联合顺铂/氯化镉作用后可更进一步增加这三者的表达。与SMMC-7721细胞相比,SMMC-7721/Smac细胞生长缓慢,caspase-3、-9和Cyt c蛋白表达水平较高,联合顺铂/氯化镉作用后,这三种蛋白的表达均明显增加。本研究为以Smac为基础的肿瘤基因治疗,肝癌临床治疗效果的改善,以及氯化镉作为抗肝癌药物的开发提供实验依据。

论文目录

  • 内容提要
  • 英文缩写
  • 第1章 绪论
  • 1.1 肝癌治疗的研究进展
  • 1.2 肿瘤基因治疗及其研究现状
  • 1.3 细胞凋亡与肿瘤
  • 1.3.1 细胞凋亡的形态和生化特征
  • 1.3.2 细胞凋亡的检测方法
  • 1.3.2.1 形态学方法
  • 1.3.2.2 生物化学方法
  • 1.3.3 细胞凋亡信号转导通路
  • 1.3.3.1 线粒体介导的凋亡途径
  • 1.3.3.2 死亡受体介导的凋亡途径
  • 1.3.4 细胞凋亡相关因子
  • 1.3.4.1 caspases家族
  • 1.3.4.2 细胞色素c
  • 1.3.5 细胞凋亡在肿瘤发生、治疗中的作用
  • 1.3.5.1 细胞凋亡与肿瘤发生
  • 1.3.5.2 细胞凋亡与肿瘤治疗
  • 1.4 Smac/DIABLO和肿瘤
  • 1.4.1 Smac/DIABLO的生物学特征
  • 1.4.2 Smac/DIABLO的促凋亡作用
  • 1.4.3 Smac/DIABLO与肿瘤的关系
  • 1.5 顺铂与肿瘤
  • 1.5.1 顺铂的抗肿瘤作用
  • 1.5.2 顺铂与细胞凋亡
  • 1.6 镉与肿瘤
  • 1.6.1 镉的抗肿瘤作用
  • 1.6.2 镉与细胞凋亡
  • 第2章 材料与方法
  • 2.1 主要试剂及器材
  • 2.1.1 试剂
  • 2.1.2 器材
  • 2.1.3 主要仪器
  • 2.3 质粒与菌株
  • 2.4 细胞株
  • 2.5 顺铂和氯化镉的配制
  • 2.6 细胞生物学实验方法
  • 2.6.1 培养液配制
  • 2.6.2 胎牛血清制备
  • 2.6.3 D-Hank’s液的配制
  • 2.6.4 胰酶的配制
  • 2.6.5 细胞培养
  • 2.6.6 细胞冻存
  • 2.6.7 细胞转染
  • 2.6.8 细胞毒性检测
  • 2.6.9 细胞凋亡检测
  • 2.6.9.1 AO/EB双荧光法检测细胞凋亡
  • 2.6.9.2 FCM检测细胞凋亡
  • 2.6.10 免疫细胞化学法检测caspase-3、-9 和Cyt c蛋白的表达
  • 2.7 分子生物学实验方法
  • 2.7.1 细菌培养技术
  • 2.7.1.1 细菌LB培养基的配制
  • 2.7.1.2 细菌复苏
  • 2.7.1.3 细菌培养
  • 2.7.1.4 细菌冻存
  • 2.7.1.5 感受态菌的制备（氯化钙法）
  • 2.7.1.6 细菌转化
  • 2.7.1.7 质粒提取
  • 2.7.2 重组表达载体的构建
  • 2.7.2.1 细胞总RNA提取
  • 2.7.2.2 RNA的定量
  • 2.7.2.3 引物设计及合成
  • 2.7.2.4 RT-PCR法钓取人全长型Smac（FL hSmac）基因CDs序列
  • 2.7.2.5 琼脂糖凝胶电泳
  • 2.7.2.6 DNA操作
  • 2.7.2.7 重组子的鉴定
  • 2.7.2.8 目的基因的表达
  • 2.7.3 G418 筛选稳定过表达Smac基因的细胞株
  • 2.7.3.1 确定G418 筛选浓度
  • 2.7.3.2 稳定过表达Smac基因细胞株的G418 筛选
  • 2.8 统计学方法
  • 第3章 结果
  • +-FL hSmac的构建'>3.1 重组质粒pcDNA3.1+-FL hSmac的构建
  • 3.1.1 人全长型Smac基因的克隆及鉴定
  • +-FL hSmac的构建及鉴定'>3.1.2 重组质粒pcDNA3.1+-FL hSmac的构建及鉴定
  • +-FL hSmac在人肝癌细胞株SMMC-7721 中的表达'>3.2 重组质粒pcDNA3.1+-FL hSmac在人肝癌细胞株SMMC-7721 中的表达
  • 3.2.1 细胞转染条件的优化及转染效率的测定
  • +-FL hSmac在SMMC-7721 细胞中的表达..'>3.2.2 重组质粒pcDNA3.1+-FL hSmac在SMMC-7721 细胞中的表达..
  • 3.2.2.1 Smac mRNA水平表达情况
  • 3.2.2.2 Smac蛋白水平表达
  • 3.3 瞬时Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞的影响
  • 3.3.1 顺铂剂量的选择
  • 3.3.2 氯化镉剂量的选择
  • 3.3.3 瞬时Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞增殖的影响
  • 3.3.4 瞬时Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞凋亡的影响
  • 3.3.4.1 AO/EB法检测细胞凋亡
  • 3.3.4.2 FCM检测细胞凋亡
  • 3.3.5 瞬时Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞凋亡调控相关因子表达的影响
  • 3.3.6 稳定Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞凋亡相关因子的影响
  • 3.3.6.1 稳定Smac基因过表达的人肝癌细胞株的建立
  • 3.3.6.2 SMMC-7721/Smac细胞的生长特性
  • 3.3.6.3 稳定Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞凋亡相关因子的影响
  • 第4章 讨论
  • +-FL hSmac重组质粒的构建及表达'>4.1 pcDNA3.1+-FL hSmac重组质粒的构建及表达
  • 4.1.1 人全长型Smac基因的克隆
  • +-FL hSmac重组质粒的构建'>4.1.2 pcDNA3.1+-FL hSmac重组质粒的构建
  • +-FL hSmac重组质粒在SMMC-7721 中的表达'>4.1.3 pcDNA3.1+-FL hSmac重组质粒在SMMC-7721 中的表达
  • 4.2 稳定高效过表达Smac的人肝癌细胞株的建立及其生长特性
  • 4.3 Smac基因过表达对肝癌细胞的影响
  • 4.3.1 瞬时Smac基因过表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
  • 4.3.2 瞬时Smac基因过表达对肝癌细胞凋亡调控相关因子的影响
  • 4.4 Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞的影响
  • 4.4.1 瞬时Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞增殖的抑制作用
  • 4.4.2 瞬时Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞凋亡的影响
  • 4.4.3 瞬时/稳定Smac基因过表达联合顺铂/氯化镉对肝癌细胞凋亡调控相关因子表达的影响
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果
  • 致谢
  • 中文摘要
  • ABSTRACT

    • 相关论文文献

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