论文摘要
微生物谷氨酰胺转移酶（MTG）可催化蛋白中谷氨酰胺和赖氨酸残基发生酰基转移反应，使蛋白之间发生交联，进而改善蛋白的功能性质，现已被应用于肉制品加工中以提高产品的品质。然而，MTG在实际应用中存在产品质量不稳定的问题。鉴于氧化引起的蛋白结构变化可能改变MTG可利用底物的含量（例如氧化引起的结构展开会暴露更多的谷氨酰胺和赖氨酸底物），本研究假设羟自由基氧化能够改变MTG催化交联反应，从而改变肌原纤维蛋白（MFP）的功能性质。以期通过探索蛋白氧化与MTG交联反应之间的关系，为肉制品加工品质改善提供理论依据。本研究以猪肌原纤维蛋白（MFP）或肌球蛋白为研究对象，经羟自由基产生体系（FeCl3/抗坏血酸/H2O2，pH6.25）氧化后进行MTG交联（E:S=1:20），观察MFP或肌球蛋白的氧化对MTG交联反应的影响。主要研究内容包括：（1）氧化引起的MFP结构变化对MTG催化交联程度的影响；（2）MFP氧化对MTG催化交联后二级结构及交联部位（肌球蛋白亚片段，如S1、S2、Rod、HMM和LMM）的影响；（3）肌球蛋白氧化对MTG交联后异肽键（-CONH-）形成以及特定交联位点的影响；（4）在影响肉制品加工的常见因素条件（不同盐浓度和温度）下，MFP的氧化对MTG交联反应程度和功能性质的影响。通过研究在高盐条件（0.6mol/L NaCl）下氧化引起的MFP结构变化与MTG交联程度之间的关系，发现蛋白氧化过程中结构展开、蛋白聚集和氨基酸修饰是同时存在的，且MTG的交联程度受优势方的影响。相对于未氧化MFP的交联程度11.6%，轻度氧化MFP（1mmol/L H2O2）中结构展开占优势，暴露更多可利用的谷氨酰胺和赖氨酸底物，导致交联程度提高至27.6%；而深度氧化MFP（5和10mmol/LH2O2）中蛋白聚集和氨基酸修饰占优势，使得部分可利用的谷氨酰胺和赖氨酸残基被遮蔽或被氧化，导致交联程度低至9.6%。通过CD和FTIR光谱进一步测定了在高盐条件（0.6mol/L NaCl）下MFP氧化对MTG催化交联后二级结构的影响，发现氧化和MTG交联均导致MFP解螺旋，MTG交联引起的ɑ-螺旋变化与氧化程度相关：轻度氧化（0.1–1mmol/LH2O2）>未氧化>深度氧化（5–20mmol/L H2O2）。同时借助胰凝乳蛋白酶将MFP中的肌球蛋白水解为不同片段（S1/Rod和HMM/LMM），观察氧化对MTG交联部位的影响。结果表明，对于未氧化肌球蛋白，MTG主要交联部位为S1；对于因轻度氧化而结构展开的肌球蛋白（0.1–1mmol/L H2O2），所有片段的交联概率均增加，但S1仍是重点交联部位；对于因过度氧化（5–20mmol/LH2O2）而聚集的肌球蛋白，S2是重点交联部位。将MFP中的主要蛋白—肌球蛋白提纯，观察高盐条件下肌球蛋白氧化对MTG交联程度、交联部位和交联位点的影响，并与MFP进行比较。ε（γ-G）L测定结果表明轻度氧化肌球蛋白（1mmol/L H2O2）的反应程度为87.6%，显著高于（P<0.05）未氧化蛋白的64.7%和过度氧化蛋白（200mmol/L H2O2）的33.8%，交联程度的趋势与MFP相似。氧化肌球蛋白的交联部位与MFP也大体相似：对于未氧化肌球蛋白，交联部位主要为S1；对于轻度氧化肌球蛋白，Rod和S1交联概率均增加，S1仍是重点交联部位；过度氧化肌球蛋白因无法严格水解为特定片段（S1/Rod或HMM/LMM）而无法判断其交联部位。此外，与过度氧化的肌球蛋白不同的是，未氧化和轻度氧化的肌球蛋白经MTG交联后会生成不易水解为S1和Rod的聚集物。通过MALDI-TOF/TOF MS找到了该聚集物中两个可能的交联位点：由肌球蛋白头部789–794（IQAQAR）肽段中的790谷氨酰胺残基与800–804（IEFKK）肽段中的803赖氨酸残基交联所形成的IQ（IEFKK）AQAR，以及由肌球蛋白头部560–567（SNNFQKPR）肽段中的565赖氨酸残基与肌球蛋白尾部1872–1875（LQLK）肽段中的1872谷氨酰胺残基交联所形成的SNNFQK（LQLK）PR。将MFP在三种盐浓度（0.15、0.45和0.6mol/L NaCl）下进行氧化，随后在三种温度（4、15和30°C）下进行交联，观察在常见的肉制品加工条件下氧化对MTG交联反应以及后续凝胶性能的影响。发现在上述所有条件下，氧化MFP的交联程度几乎均高于未氧化MFP，且随着盐浓度和温度的增加而升高。例如，15°C高盐2h氧化样品的交联程度为46.8%，高于相同条件下未氧化样品的31.6%，远远高于15°C低盐2h氧化样品的27.2%以及4°C高盐2h氧化样品的18.2%。MFP的氧化对MTG交联后凝胶性能的影响主要通过凝胶强度和动态流变学进行测定，结果表明，高盐氧化样品经4°CMTG处理后凝胶强度的增加量（92.6%–120.3%）大于未氧化样品（79.0%），然而提高温度等过度交联条件反而不利于凝胶网络结构的形成。在两种交联温度（4和15°C）下，低盐氧化样品经MTG处理后凝胶强度的增加量均小于未氧化样品。动态流变学测定结果表明两种盐浓度的氧化MFP经MTG处理后最终储能模量的变化幅度均大于未氧化MFP的。可见，高盐MFP的氧化是一个辅助MTG提高蛋白功能性质的有效手段。总之，本课题研究了MFP氧化对MTG催化交联反应（交联程度、交联部位和交联位点）的影响，并通过MFP的凝胶性能进行了验证，阐明了MFP氧化对MTG交联的影响机理，为解决MTG实际应用中出现的问题提供了理论依据，以利于制定应对策略。