论文摘要
睫状神经营养因子（CNTF）是神经性细胞因子家族的成员,在体内具有多种生物学功能,主要作用对象是神经系统,对多种神经细胞都有作用,可促进这些神经细胞的分化、生长,支持其生存,促进神经损伤后的再生和修复。CNTF作为一种肯定的能促进神经再生的营养因子,可用于多种疾病的治疗研究,如亨廷顿舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病、视网膜变性疾病、脑损伤、听神经和视神经损伤等。已报道的给药途径主要包括外周系统给药、大脑实质直接注射、侧脑室给药、鞘内注射、前房内注射、及玻璃体内注射等,外周给药,创伤性小,但受到血脑屏障的严重影响,进入大脑实质的量非常有限;后几种方式虽然作用部位直接,给药量容易控制,但创伤性风险大,应用困难。CNTF是蛋白质大分子,很难透过血脑屏障,从而限制了其在中枢的治疗应用,目前细胞移植和基因治疗方面的研究虽然在动物实验中取得了一些进展,由于这些治疗方案都采取手术和脑室注射等创伤性手段,离临床应用尚有很大的距离。蛋白转导域（PTD）介导的蛋白质治疗是一种极其方便而且高效的蛋白质转导方法,利用PTD的介导可以快捷有效地使外源性蛋白质通过外周血、腹腔等途径,跨越血脑屏障进入脊髓、脑组织细胞,在运送蛋白质、DNA或复合物治疗病毒感染、特异性杀伤肿瘤细胞及神经退行性疾病等方面有巨大的潜力,为神经系统疾病的治疗提供新的研究思路。因此根据现有的重组人CNTF半衰期短、稳定性差和存在免疫原性等问题将其基因进行改构,去掉容易降解的N端序列,删除产生免疫原性的C端序列,只保留必要的活性区域,采用重叠延伸PCR技术获得截短式CNTF活性片段,然后将转导效率较高的蛋白转导域TAT的核苷酸序列与改构的CNTF基因重组并原核高效表达出融合蛋白TAT-tCNTF。体外实验证明TAT-tCNTF具有明显的促进TF-1细胞生长的活性,促进细胞的增殖,并且具有明显的剂量依赖关系;促进SH-SY5Y细胞增殖与分化,并对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞损伤有保护作用,能明显的抑制损伤细胞的凋亡和坏死。将TAT与CNTF融合表达结合了两者的优势,以期无创进入脑组织达到治疗中枢神经退行性疾病是本研究的目的,因此TAT-tCNTF能否跨过膜屏障是首要的关注点,故进行了一系列穿膜实验,结果显示TAT-tCNTF能快速进入SH-SY5Y细胞,并且不受温度的限制,存在受体以外的转运途径;并能较快进入皮肤屏障,存在剂量和时间依赖关系;TAT-tCNTF在脑实质各处均有分布,而rhCNTF只能局限地分布在脑室周围的狭小区域,而不能进入实质深处的神经元细胞,对照鲜明地说明了连接有转导肽的TAT-tCNTF成功的透过血脑屏障进入神经元;另外,静脉注射和直肠给予大鼠100μg/kg TAT-tCNTF的药代动力学行为均符合二室开放模型一级动力学消除过程。表明TAT-tCNTF能穿越细胞膜、皮肤屏障、血脑屏障和直肠粘膜屏障。因而首次获得具有跨膜转导功能并且具有比市售rhCNTF更高生物活性的截短型人睫状神经营养因子活性片段。阿尔茨海默疾病（AD）是一种进行性、致命性神经变性疾病,破坏脑细胞,引起记忆障碍,影响思考和行为能力,分析判断能力衰退、情绪改变、行为失常、甚至意识模糊,最后导致死亡。AD患病率随年龄的增加而升高。CNTF是对外周及中枢神经系统具有广谱神经营养作用和诱导分化效能的细胞因子,可促进感觉神经元、运动神经元及中枢皮质和海马神经元的存活和生长,因此是治疗神经退行性疾病的有力候选者。透射电镜显示TAT-tCNTF可抑制Aβ在体外聚集和纤维形成,故随即进行了动物实验检测TAT-tCNTF是否在体内对Aβ也有作用,能否减少毒性老年斑的形成。Morris水迷宫行为学实验表明腹腔注射和直肠给予TAT-tCNTF均可以显著改善Aβ诱导的AD模型小鼠的空间学习记忆能力,刚果红染色显示老年斑减少,可阻止Aβ沉积;同时提取海马部位总RNA,进行RT-PCR以考察TAT-tCNTF治疗对Aβ代谢和转运相关基因表达的影响。经TAT-tCNTF治疗的海马中内皮素转化酶1和胰岛素降解酶的mRNA表达明显的增加,这两种Aβ降解酶表达的增加共同对Aβ消除起到了重要作用,相辅相成,协同起效,促进Aβ降解和移除,减轻Aβ对AD模型动物的损伤,减少神经元丢失;Western blot显示能提高AD小鼠脑内海马区域的nestin和ChAT的表达,诱发神经再生,诱导神经祖细胞向胆碱能神经元分化,增加ChAT在脑中的表达水平。因此,TAT-tCNTF抑制Aβ纤维的形成,减少老年斑的形成,对减缓疾病进程,甚至阻止疾病发生起到了重要作用,更关键的是促进了神经再生,逆转了神经退行性疾病的环境。由于血脑屏障的限制,CNTF从未用于AD的治疗,TAT-tCNTF的有效转导和显著治疗效果在Aβ诱导AD模型小鼠上得到成功表现,而且直肠给药具有方便、无创、肝脏首过效应低等特点,因而在神经系统疾病治疗中的应用前景令人瞩目,这种非创伤性给药途径更使TAT-tCNTF成为AD治疗的新策略。在将CNTF用于运动神经元疾病的治疗研究当中,就意外地发现其能够导致确切的体重下降,因而又对TAT-tCNTF进行饮食诱导型肥胖（DIO）小鼠的减肥治疗研究,并对其减肥机制进行初步探讨。TAT-tCNTF可以使高脂饲料喂养的DIO小鼠体重增长率降低,脂肪湿重减轻,脂肪细胞变小,并降低肥胖小鼠的血糖水平,高剂量组效果更明显。TAT-tCNTF降低了神经肽Y在脑中的表达水平,减少了其增加摄食的功效。而且无论是腹腔注射还是直肠给予TAT-tCNTF对肥胖症都显示出同样的治疗作用。可见,TAT-tCNTF是一个多效因子,可以保护细胞免于死亡,抑制Aβ聚集沉积和形成老年斑,促进Aβ降解和移除,增加nestin和ChAT的表达,诱发神经再生,减轻体重,降低血糖。TAT-tCNTF不仅解决了大分子通过血脑屏障的问题,而且为中枢治疗药物提供了一条新颖无创的治疗方式。TAT-tCNTF可以通过直肠粘膜吸收进入体内,为人用舌下含服制剂的研发开辟了道路,从而增加用药安全性及患者依从性。因此,TAT-tCNTF不仅是神经退行性疾病和肥胖相关疾病的很有前途的治疗药物,而且开辟了治疗中枢神经系统疾病的非创伤性治疗途径。
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相关论文文献
- [1].TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报 2010(04)
- [2].TAT-tCNTF对CD损伤细胞的作用机制研究[J]. 中国药物应用与监测 2014(03)
- [3].TAT-tCNTF提高Aβ损伤细胞模型的GSH水平和SOD酶活性研究[J]. 中国药物应用与监测 2012(05)
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