猪脂肪细胞分化、脂肪沉积相关候选基因的分离、定位及遗传效应分析

论文摘要

脂肪组织是一种高度分化的组织，在胚胎发育晚期出现，出生后迅速增长。脂肪组织的生长包括新脂肪细胞的生成（即脂肪细胞分化）和脂肪细胞体积的增大。脂肪细胞增强子结合蛋白（The adipocyte enhancer-binding protein，AEBP1）是在小鼠的肥胖研究中发现的一个脂肪细胞分化相关的重要转录抑制因子。在脂肪组织脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein，aP2）基因启动子邻近区域AE-1存在AEBP1的识别区域，而aP2基因编码的蛋白可以作为脂肪细胞分化的标志。小鼠AEBP1基因通过选择性剪接形成两种转录本AEBP1和ACLP（Aortic carboxypeptidase-like protein，主动脉羧肽酶类样蛋白），其编码的两种蛋白AEBP1和ACLP功能完全不同。目前，猪AEBP1基因的序列、结构和功能尚未见报道，本研究首次利用电子克隆技术结合PCR，对猪AEBP1基因的部分cDNA和DNA序列进行了分离和测序，并对不同品种的猪AEBP1基因序列进行了生物信息学分析；利用猪辐射杂种克隆板（IMpRH）对猪AEBP1基因进行了染色体精细定位；利用RT-PCR方法对猪AEBP1基因是否存在不同转录本进行了鉴定，并分别对其推导的氨基酸序列进行了生物信息学分析，预测蛋白质的基本特征，同时在转录水平检测了不同转录本在猪的各个组织表达分布情况。 为了确定猪脂肪细胞分化相关基因AEBP1和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ）基因，脂肪沉积候选基因黑素皮质素-4受体（Melanocortin-4 receptor，MC4R）基因、黑素皮质素-5受体（Melanocortin-5 receptor，MC5R）基因和胰岛素样生长因子-2（insulin-like growth factors-2，IGF2）基因以及肌内脂肪含量候选基因PRKAG3（Protein Kinase Adenosine Monophosphate-Activated γ3-Subunit）的遗传学效应，以华中农业大学试验猪场2002年屠宰的大白、长白和梅山猪等三个品种和大白×长白、长白×大白、大白×梅山、梅山×大白猪（以下分别简称大长、长大、大梅、梅大）等四个杂交组合群体（共336头）以及2003、2004年屠宰的大白×梅山猪F2代群体（共290头）为试验材料，利用PCR-RFLP分子标记技术，对猪AEBP1、PPAR γ、MC4R、MC5R、IGF2和PRKAG3进行了基因型分型，并与背膘厚等胴体性状、肌内脂肪含量等肉质性状进行关联性分析；此外，为了筛选更多的SNP，对猪脂肪细胞分化相关基因脂肪细胞定向和分化因子（adipocyte determination and differentiation dependent factor 1，ADD1）基因的不同猪品种DNA进行分离、测序并进行序列比对，取得了以下结果： 1．猪AEBP1基因cDNA和DNA序列的分离、测序和序列分析：以人AEBP1基因序列作为探针，在NCBI的EST数据库中比对得到猪EST序列并进行拼接。根

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 资源家系测定性状的英文缩写
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 脂肪细胞分化相关基因研究进展
• 2.1 脂肪细胞分化相关转录因子PPARs基因家族
• 2.2 脂肪细胞分化相关转录因子ADD1基因
• 2.3 脂肪细胞分化相关转录因子AEBP1基因
• 3 脂肪沉积相关基因研究进展
• 3.1 脂肪沉积相关基因MC4R和MC5R
• 3.2 脂肪沉积相关基因IGF2
• 4 糖原合成与代谢相关基因PRKAG3研究进展
• 5 猪新基因的分离方法
• 6 基因定位的方法与研究现状
• 7 mRNA选择性剪接
• 8 本研究的目的和意义
• 第二章 猪脂肪细胞分化相关基因AEBP1的分离、定位、转录本鉴定和组织表达谱研究
• 1 引言
• 2 试验材料
• 2.1 试验样品
• 2.1.1 猪组织样品
• 2.1.2 猪血液样品
• 2.1.3 基因定位所用的猪辐射杂种克隆板（IMpRH）
• 2.2 主要仪器和设备
• 2.3 主要药品及试剂
• 2.4 缓冲液及常用试剂的配制
• 2.5 主要生物学软件
• 3 试验方法
• 3.1 猪AEBP1基因cDNA的分离
• 3.1.1 猪组织RNA的提取和cDNA第一链的合成
• 3.1.2 依据电子克隆策略设计引物
• 3.1.3 RT-PCR方法扩增cDNA
• 3.1.4 PCR产物回收、克隆、测序和生物信息学分析
• 3.2 猪AEBP1基因组DNA的分离
• 3.2.1 猪血液基因组DNA的提取、浓度测定及质量检测
• 3.2.2 根据猪AEBP1基因的cDNA序列设计引物
• 3.2.3 猪AEBP1基因内含子的PCR扩增
• 3.2.4 PCR产物回收、克隆、测序和生物信息学分析
• 3.3 猪AEBP1和PNPLA2基因染色体精细定位
• 3.3.1 猪AEBP1基因定位所用引物
• 3.3.2 猪PNPLA2基因定位所用引物
• 3.3.3 PCR扩增分型
• 3.3.4 数据分析
• 3.4 猪AEBP1／MCLP转录本的鉴定
• 3.4.1 引物设计
• 3.4.2 RT-PCR方法鉴定AEBP1／ACLP转录本
• 3.5 猪AEBP1／ACLP转录本推导的蛋白质基本特征分析
• 3.6 猪AEBP1／ACLP转录本转录水平组织表达谱分析
• 3.6.1 RT-PCR反应
• 3.6.2 猪AEBP1／ACLP转录本RT-PCR反应产物的检测
• 4 结果与分析
• 4.1 猪AEBP1基因cDNA的分离结果
• 4.1.1 猪组织总RNA的提取
• 4.1.2 猪AEBP1基因各引物的RT-PCR扩增及测序
• 4.1.3 猪AEBP1基因cDNA序列的生物信息学分析
• 4.2 猪AEBP1基因组DNA的分离结果
• 4.2.1 猪AEBP1基因DNA片段扩增结果
• 4.2.2 猪AEBP1基因DNA序列生物信息学分析
• 4.3 猪AEBP1和PNPLA2基因的染色体精细定位
• 4.4 猪AEBP1／ACLP转录本鉴定结果
• 4.5 猪AEBP1／ACLP转录本推导的蛋白质基本特征分析
• 4.6 猪AEBP1／ACLP转录本转录水平组织表达谱
• 5 讨论
• 5.1 分离猪AEBP1基因cDNA序列的策略
• 5.2 猪AEBP1基因SNPs在基因组的分布
• 5.3 猪AEBP1基因的定位
• 5.4 猪AEBP1／ACLP转录本的鉴定
• 5.5 猪AEBP1／ACLP转录本的表达差异
• 第三章 猪脂肪细胞分化相关基因AEBP1,PPARγ和ADD1的SNPs及性状关联分析
• 1 引言
• 2 试验材料
• 2.1 试验猪群体和性状测定
• 2.2 主要仪器设备及试剂
• 2.3 PCR扩增引物
• 2.4 主要生物学软件
• 3 试验方法
• 3.1 猪AEBP1、PPARγ和ADD1基因PCR扩增和序列分析
• 3.1.1 PCR扩增
• 3.1.2 PCR产物电泳检测
• 3.1.3 猪ADD1基因序列分析
• 3.2 猪AEBP1和PPARγ基因PCR-RFLP分析
• 3.3 统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 猪AEBP1、PPARγ和ADD1基因PCR扩增结果
• 4.2 猪ADD1基因的序列分析
• 4.3 猪AEBP1和PPARγ基因PCR-RFLP结果
• 4.4 猪AEBP1、PPARγ基因型频率及性状关联分析
• 4.4.1 猪AEBP1基因的基因型频率及性状关联分析
• 4.4.2 猪PPARγ基因型频率及性状关联分析
• 5 讨论
• 5.1 内含子SNPs的生物学效应
• 5.2 猪AEBP1和PPARγ基因在不同群体中基因型频率分布
• 5.3 猪AEBP1和PPARγ基因遗传效应分析
• 5.4 猪ADD1基因的SNPs
• 第四章 猪脂肪沉积候选基因MC4R、MC5R和IGF2的性状关联分析
• 1 引言
• 2 试验材料
• 2.1 试验猪群体和性状测定
• 2.2 主要药品及试剂
• 2.3 PCR扩增引物
• 2.4 主要生物学软件
• 3 试验方法
• 3.1 猪MC4R、MC5R和IGF2基因PCR扩增及检测
• 3.1.1 PCR扩增
• 3.1.2 PCR产物的电泳检测
• 3.2 猪MC4R、MC5R和IGF2基因PCR-RFLP分析
• 3.3 统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 猪MC4R、MC5R和IGF2基因PCR扩增结果
• 4.2 猪MC4R、MC5R和IGF2基因PCR-RFLP结果
• 4.3 猪MC4R、MC5R和IGF2基因型频率及性状关联分析
• 4.3.1 猪MC5R基因型频率及性状关联分析
• 4.3.2 猪MC4R基因型频率及性状关联分析
• 4.3.3 猪IGF2基因型频率及性状关联分析
• 5 讨论
• 5.2 猪MC4R、MC5R和IGF2基因在不同群体中基因型频率分布
• 5.2 候选基因的遗传效应分析
• 第五章 糖原代谢相关基因PRKAG3的性状关联分析
• 1 引言
• 2 试验材料
• 2.1 试验猪群体和性状测定
• 2.2 主要药品及试剂
• 2.3 PCR扩增引物
• 2.4 主要生物学软件
• 3 试验方法
• 3.1 猪PRKAG3基因扩增及检测
• 3.1.1 PCR扩增
• 3.1.2 PCR产物的电泳检测
• 3.2 猪PRKAG3基因PCR-RFLP分析
• 3.3 统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 猪PRKAG3基因PCR扩增结果
• 4.2 猪PRKAG3基因PCR-RFLP结果
• 4.3 猪PRKAG3基因型频率及性状关联分析
• 4.3.1 I199V和G52S位点基因型频率分布
• 4.3.2 199V和G52S位点基因型与猪肌内脂肪含量的关联分析
• 4.3.3 I199V和G52S位点基因型与pH值的关联分析
• 4.3.4 I199V和G52S位点基因型与失水率等性状的关联分析
• 5 讨论
• 5.1 猪PRKAG3基因在不同群体中基因型频率分布
• 5.2 猪PRKAG3基因遗传效应分析
• 小结
• 下一步工作
• 参考文献
• 在读期间发表论文题录
• 附录
• 致谢