论文摘要
电压门控钠通道是位于可兴奋性细胞膜上的重要离子通道之一,其活动与动作电位去极化相形成和快速扩布密切相关。目前,科学家们从动物毒液（如蝎、芋螺、蜘蛛等）中获取的毒素分子因活性强和专一性高,已成为鉴定钠通道亚型和分析钠通道结构与功能关系的重要工具试剂。虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ（huwentoxin-Ⅳ,HWTX-Ⅳ）是从虎纹捕鸟蛛（Ornithoctonus huwena）粗毒中分离获得的一种多肽类神经毒素,相对分子质量为4107.5 Da,含有35个氨基酸残基和3对二硫键,采用了典型的抑制剂胱氨酸结（cystine inhibitor knot,ICK）模体结构。电生理实验表明,HWTX-Ⅳ能选择性抑制哺乳动物感觉神经元河豚毒素敏感型（tetrodotoxin-sensitive,TTX-S）钠通道的激活。TTX敏感型钠通道在生物体内分布广泛,而HWTX-Ⅳ作为一种新型神经性钠离子通道阻断剂,被认为是研究钠通道结构与功能的重要工具试剂以及具有药物开发前景的先导分子。为了深入研究其结构和功能关系,进一步挖掘HWTX-Ⅳ的潜在应用价值,本研究,采用芴甲氧羰基（Fmoc）固相多肽化学合成法,对该多肽类毒素进行了全化学合成,并探索出了一个较佳的氧化复性条件:0.1 mol/LTris-HCl,0.1 mol/L NaCl,5 mmol/L GSH,0.5 mmol/L GSSG（pH=7.8）,产率达95%。经MALDI-TOF质谱技术鉴定,复性产物相对分子质量为4107.5 Da,与天然毒素混合进行HPLC分析可得到单一洗脱峰。电生理实验证明,在全细胞膜片钳记录模式下,化学合成和天然HWTX-Ⅳ对成年大鼠背根神经节细胞TTX敏感型钠通道有相同的选择性,且抑制活性强度一致。上述结果表明,HWTX-Ⅳ能被化学合成,与天然毒素在结构和功能上具有一致性。我们同样发现,天然的和化学合成的HWTX-Ⅳ都对胎鼠海马神经元钠通道有明显抑制作用,但是其抑制活性(IC50约0.4μM)为对外周神经元钠通道的1/12。此外,通过毒素与脂质体的离心共沉淀实验分析证实HWTX-Ⅳ与Thrixopelma pruriens捕鸟蛛中分离得到的ProTx-Ⅱ不同,HWTX-Ⅳ不具有与中性及负电荷人工双分子层磷脂相结合的能力。这些研究证明,HWTX-Ⅳ作为外周神经元钠通道偏好抑制剂,其作用机制可能与ProTx-Ⅱ大不相同。另一方面,为了确定HWTX-Ⅳ作用于钠通道的关键残基,通过固相化学合成的方法,将HWTX-Ⅳ进行了四个点位突变（Lys27Ala、Thr28Asp、Arg29Ala、Gln34Asp）。结果发现突变体Thr28Asp、Arg29Ala和Gln34Asp抑制钠通道的能力分别为天然毒素的1/12,1/260和1/24,证明Thr28、Arg29和Gln34应该是虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ结合钠通道的关键残基。