论文摘要
Peutz-Jephers综合症（Peutz-Jeghers syndrome,PJS）是以多发性错构瘤样胃肠道息肉和粘膜色素沉着为主要临床表现且具有高度肿瘤易感性的常染色体显性遗传性疾病,抑癌基因STK11（也称之为LKB1）是PJS的致病基因。STK11的编码产物是长为433aa的丝/苏氨酸蛋白激酶STK11,在胞浆胞核均有分布。互作蛋白的发现为了解STK11的功能及解释PJS高度肿瘤易感机制起到了重要作用。STK11与P53存在相互作用,STK11以依赖于p53的方式来促进细胞周期素依赖性激酶p21的表达从而实现其细胞周期阻滞作用,同时通过P53的介导,过表达的STK11还可以转定位于线粒体膜,经线粒体途经诱导细胞凋亡。与STRAD、MO25结合形成异三聚体的STK11激酶活性明显增强,磷酸化激活下游底物如AMPK促进分解代谢,或AMPK相关蛋白MARK3/PAR1A参与细胞极性调控网络。陆续发现其他与STK11互作的蛋白质如Brg-1、LIP-1、FLIP-1、AGS3等也同时提示STK11可能从多个路径参与调节细胞生长凋亡、能量代谢和细胞极性形成等生理过程。我们曾采用GST Pull down技术和免疫共沉淀实验在L02细胞中筛选并验证了STK11新的功能未知的互作蛋白LOH12CR1。进化上高度保守的LOH12CR1是否具有较为重要的功能是我们所关注的问题,因此我们在生物信息学分析的基础上,利用EGFP分子标签观察LOH12CR1在细胞内的定位,同时利用Realtime-PCR检测LOH12CR1在多种细胞株中的表达水平,并进一步通过细胞生长曲线绘制和细胞克隆计数观察了LOH12CR1过表达对细胞生长和增殖的影响。研究发现:①LOH12CR1这个进化上高度保守的“孤儿”蛋白可能存在下列翻译后修饰位点:LOH12CR1不属于任一已知蛋白家族,其蛋白序列中不存在与已知的蛋白功能模序相匹配的结构域,但可能存在1个N端豆蔻酰化位点、2个N端糖基化位点、一个CK2磷酸化位点;②LOH12CR1主要定位于胞浆:共聚焦显微镜下观察分别过表达pEGFP-C2-LOH12CR1重组蛋白的L02（STK11阳性表达）、HeLa（STK11阴性表达）细胞,发现绿色荧光均主要呈粗斑点状散布于胞浆之中,极少数可见定位于胞核内。两种细胞中,外源性LOH12CR1的定位相同,提示STK11的内源性表达可能并不影响LOH12CR1的亚细胞定位;③LOH12CR1在多种肿瘤细胞中表达:Realtime-PCR检测发现LOH12CR1在所选取的L02、COS7、Bel7402、HMC、Huh-7、Hela、Hela-WT、HL60、HT-29、及HCT116细胞株中均有表达。LOH12CR1在HeLa细胞中的表达水平较在HeLa-STK11+中高出5.79倍（P＜0.05）,这提示STK11的稳定表达可能下调LOH12CR1的表达水平;④LOH12CR1具有抑制细胞生长和增殖的作用:过表达LOH12CR1的HeLa、HCT116细胞克隆形成率和生长活性均明显降低,这提示LOH12CR1对细胞生长增殖具有抑制作用。通过本课题的研究,我们在对LOH12CR1再次进行了信息学预测的基础上,本文首次明确了LOH12CR1在LO2细胞中的胞浆定位情况,并发现过表达的LOH12CR1具有抑制细胞生长和增殖的作用,从而对LOH12CR1这一功能尚未得到发掘的STK11互作蛋白有了粗浅的认识,为今后对LOH12CR1的功能研究提供了切入点。