组织工程角膜基质种子细胞及其在微重力环境中的培养研究

论文摘要

目的:（1）研究兔角膜基质细胞、兔骨髓间充质干细胞在体外培养的生物学特性,为组织工程角膜的构建奠定基础。（2）探讨在模拟微重力条件下兔角膜基质细胞在复合材料上的三维生长特性,为构建组织工程角膜提供新的途径。方法:（1）采用组织块法、Ⅱ型胶原酶消化法获取原代兔角膜基质细胞,观察细胞贴壁情况,待细胞融合时进行消化传代,每天观察传代细胞的形态和生长情况。（2）采用差速贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞,观察细胞的形态和生长情况。（3）采用Ⅱ型胶原酶消化法获取原代兔角膜基质细胞,以密度为1×105/mL将第4-5代细胞种植于无菌复合载体材料上。以模拟微重力条件下培养兔角膜基质细胞为实验组与传统静态培养系统进行细胞培养作对照。分别在6、12、18d取细胞和载体行苏木精-伊红染色光镜观察、扫描电镜和共聚焦显微镜观察;在3、6、9、12、15、18 d取出行CCK-8法检测细胞增生功能。结果:（1）植块法培养兔角膜基质细胞,5-6d后开始有细胞从粘附紧密的植块边缘长出,培养2w-3w左右,细胞基本达到融合形成活性良好的单层。消化法接种兔角膜基质细胞,4h后开始贴壁,培养5-6d细胞达到融合形成活性良好的单层。二种方法得到的细胞在经多次传代后原有的形态和增殖功能未见明显改变。（2）细胞接种24h后换液去除悬浮细胞,细胞散在分布,10-12d后细胞基本达融合成单层。随传代次数增加细胞折光性增强,胞质内可见空泡。（3）兔角膜基质细胞对照组只在材料表面可见单层细胞;实验组大量细胞与载体黏附紧密且生长入载体内部,载体材料降解显著。扫描电镜下实验组可见细胞胞体小且突触丰富,培养第18d细胞在材料表面分泌大量胶原膜样物;模拟微重力系统促进了细胞增殖（P=0.004）。结论:（1）本研究探讨了兔角膜基质细胞、兔骨髓间充质干细胞在体外培养的生物学特性,并对比了不同的细胞培养方法、分离方法的特点。（2）模拟微重力环境中在复合材料上培养的兔角膜基质细胞更接近生理状态,更适用于组织工程三维构建,为构建更接近生理状态的组织工程角膜提供了依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 组织工程角膜基质的研究
• 2 模拟微重力环境的动态培养系统
• 3 模拟微重力环境进行组织工程及角膜基质构建的研究现状
• 4 骨髓间充质干细胞的研究
• 5 本研究的目的和意义
• 参考文献
• 第一部分 组织工程兔角膜基质相关种子细胞研究
• 引言
• 一、体外培养兔角膜基质细胞
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 二、兔骨髓间充质干细胞体外培养的初步探讨
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 模拟微重力条件下兔角膜基质细胞在复合载体材料上的三维培养
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 全文结论
• 英文缩略词
• 在读期间发表文章
• 致谢