日本囊对虾雌雄性腺差异表达基因的克隆与分析

论文摘要

日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）系甲壳动物,是我国沿海重要的经济养殖种类。其性别控制是水产遗传育种的研究热点。目前人们对包括虾蟹在内的甲壳动物性腺差异的分子机制仍认识有限,因此研究对虾精巢、卵巢差异表达基因具有重要的理论意义和应用前景。退火控制引物技术（annealing control primer）是一种在mRNA差异显示PCR（ mRNA differential display PCR）基础上发展起来的克隆差异表达基因的新方法。本研究利用ACP技术,选择20对ACP随机引物分别对日本囊对虾精巢和卵巢cDNA进行扩增,获得8个差异基因。其中凝血酶敏感蛋白基因（thrombospondin）和皮质棒蛋白基因（cortical rod protein-2）是卵巢显著表达的基因。增殖细胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen）和泛素缀合酶基因（ubiquitin-conjugating enzyme 2r）在精巢表达量高于卵巢的基因。其余基因为未知基因。RACE技术获得增殖细胞抗原基因和泛素缀合酶基因的cDNA序列全长,序列分析显示增殖细胞抗原基因cDNA序列包括923个碱基,其中包括75 bp的5’端的非编码区（5’untranslated region ）。783bp的开放阅读框（open reading frame）,65 bp的3’的非编码区（3’untranslated region ）（除去polyA部分）,该开放阅读框编码260个氨基酸序列。泛素缀合酶基因cDNA序列全长为1477 bp,包括651 bp的5’的非编码区,85 bp的3’的非编码区（除去polyA部分）,以及一个编码241个氨基酸的开放阅读框。荧光定量PCR分析证实了ACP技术所获得的结果并进一步发现了各个差异基因在精巢和卵巢的不同发育阶段的表达特点,各个基因在精巢和卵巢的发育过程中变化显著,说明这些基因在性腺发育过程中起着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 日本囊对虾形态特征、自然分布及生活习性
• 1.2 性腺发育及性别分化的相关研究
• 1.3 本研究的背景和目的意义
• 1.4 ACP 技术的基本原理、特点及研究进展
• 1.5 本研究的内容和技术路线
• 1.6 增殖细胞核抗原基因的研究进展
• 1.7 泛素缀合酶基因的研究进展
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 日本囊对虾
• 2.1.2 主要试剂盒
• 2.1.3 本实验室自配的溶液
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 ACP 方法获得日本囊对虾性腺差异表达基因
• 2.2.1.1 总 RNA 提取及检测
• 2.2.1.2 利用dT-ACP 合成cDNA 第一条链
• 2.2.1.3 20 对 ACP 随机引物分别对精巢和卵巢cDNA 进行 PCR 扩增
• 2.2.1.4 割胶纯化基因片段
• 2.2.1.5 与质粒载体连接
• 2.2.1.6 感受态细胞的转化及筛选
• 2.2.1.7 质粒 DNA 的提取
• 2.2.1.8 质粒插入片段的检测
• 2.2.1.9 质粒测序
• 2.2.1.10 测序结果比对
• 2.2.2 RACE 方法获得 PCNA 及 UBE2r 基因cDNA 全长
• 2.2.2.1 RACE 引物设计
• 2.2.2.2 RACE cDNA 第一条链的合成
• 2.2.2.3 PCNA RACE-PCR 特异性扩增
• 2.2.2.4 UBE2r 基因 RACE-PCR 特异扩增
• 2.2.2.5 割胶纯化目的基因片段
• 2.2.2.6 与质粒载体连接
• 2.2.2.7 连接产物的转化
• 2.2.2.8 质粒 DNA 的提取
• 2.2.2.9 质粒插入片段的检测
• 2.2.2.10 质粒测序
• 2.2.2.11 测序结果拼接
• 2.2.2.12 目的基因的同源性分析及分子进化分析
• 2.2.3 荧光定量 PCR 反应分析各基因在精巢和卵巢不同发育时段的表达
• 2.2.3.1 各个发育时期的总 RNA 的提取
• 2.2.3.2 合成cDNA 第一条链
• 2.2.3.3 实时荧光定量 PCR 引物
• 2.2.3.4 实时荧光定量 PCR 反应体系及条件
• 2.2.3.5 荧光定量 PCR 所获得的条带的测序
• 2.2.3.6 数据分析
• 第三章 结果
• 3.1 ACP 方法获得日本囊对虾性腺差异表达基因
• 3.1.1 总 RNA 提取的结果
• 3.1.2 ACP 方法获得的日本囊对虾性别差异基因
• 3.1.3 差异条带测序结果
• 3.2 PCNA 基因全长的获得及序列分析
• 3.2.1 PCNA 基因的 RACE 扩增结果
• 3.2.2 PCNA 基因的cDNA 序列分析
• 3.2.3 PCNA 基因和其他物种 PCNA 基因的比较分析
• 3.2.4 荧光定量 PCR 分析 PCNA 基因在精巢和卵巢不同发育时期的表达
• 3.2.4.1 PCNA 基因的熔解曲线
• 3.2.4.2 PCNA 基因定量 PCR 扩增片段的测序
• 3.2.4.3 PCNA 基因在不同发育时期的表达情况
• 3.3 UBE2r 基因全长的获得及序列分析
• 3.3.1 UBE2r 基因的 RACE 扩增结果
• 3.3.2 UBE2r基因的cDNA 序列分析
• 3.3.3 UBE2r和其他物种 UBE2r 的比较分析
• 3.3.4 荧光定量PCR 分析UBE2r基因在精巢和卵巢不同发育时期的表达
• 3.3.4.1 UBE2r 基因的熔解曲线
• 3.3.4.2 UBE2r 基因定量 PCR 扩增片段的测序
• 3.3.4.3 UBE2r 基因基因在不同发育时期的表达情况
• 3.4 荧光定量 PCR 分析4 个未知基因在精巢和卵巢不同发育时期的表达
• 3.4.1 溶解曲线
• 3.4.2 4 个未知基因定量表达结果
• 第四章 讨论
• 4.1 增殖细胞核抗原基因
• 4.2 泛素缀合酶基因
• 4.3 ACP 方法获得的其它差异表达基因
• 4.3.1 ACP16
• 4.3.2 ACP18
• 4.3.3 ACP3、ACP4-T、ACP4-O、ACP15 基因
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文