草莓和苹果DNA甲基转移酶基因分离及表达分析

论文摘要

随着植物微繁殖技术的广泛应用,组织培养导致的表观遗传变异问题引起了人们的重视。DNA甲基化是基因组DNA的一种重要的表观遗传修饰方式,在植物基因组中普遍存在,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用。DNA甲基转移酶是DNA甲基化过程中的催化酶。本文首次分离了草莓中具有维持甲基化和重新甲基化功能的MET1类和DRM类DNA甲基转移酶基因全序列,利用实时定量PCR技术研究了两类DNA甲基转移酶基因在草莓微繁殖苗及其后代间的表达差异,同时探讨了病毒对DNA甲基转移酶基因表达的影响;此外,还利用半定量RT-PCR技术对两类基因在‘寒富’苹果二倍体与四倍体中的表达进行了分析。主要结果如下:1.采用PCR简并引物扩增的方法分别从草莓和苹果中分离出了1条和2条MET1类DNA甲基转移酶基因片段。目的片段长度443bp,包含两个完整的基序（motif）（Ⅳ和Ⅵ）和两个不完整的基序（Ⅱ和Ⅶ）。从草莓和苹果中分别分离出了2条DRM类DNA甲基转移酶基因片段。目的片段长度323bp,包含两个完整的基序（Ⅰ和Ⅲ）和两个不完整的基序（Ⅹ和Ⅳ）。2.采用染色体步移技术分离出草莓DNA甲基转移酶基因全序列。对于MET1基因,基因全序列的获得经过了1步3′下游步移和3步5′上游步移。得到较长特异片段依次为1634,1812,1308和2786 bp,重叠区域分别为57,76,87和195 bp。4步步移拼接后得到的片段长8171 bp。对于DRM基因,基因全序列的获得经过了1步3′下游步移和4步5′上游步移,得到较长特异片段依次为1405,1835,2354,2142和1847 bp,重叠区域分别为131,75,64,250和372 bp。5步步移拼接后得到的片段长9014 bp。3.根据染色体步移得到的基因全序列设计分段引物进行分段扩增,并通过5′和3′RACE试验从草莓中分离得到2条MET1类DNA甲基转移酶基因cDNA全长序列,长度5032和5002 bp,分别编码1565和1557个氨基酸,分子量为173.946和173.064 kDa,命名为FaMET1a和FaMET1b。在FaMET1基因序列中预测到8个保守基序和2个BAH结构域。FaMET1a和FaMET1b基因核酸序列和氨基酸序列同源性分别为98.63%和98.72%。遗传进化分析将FaMET1与桃（PpMET1）和毛白杨（PtDMT901,PtDMT901）的MET1划分到同一组。通过5′和3′RACE试验从草莓中还分离获得了3条DRM类DNA甲基转移酶基因cDNA全长序列,长度分别为2273,2282和2288 bp,分子量依次为67.304,67.325和67.304 kDa。3条基因序列均编码596个氨基酸,分别命名为FaDRMa、FaDRMb、FaDRMc。在FaDRM基因序列中预测到7个保守基序和UBA结构域。FaDRM基因核酸序列同源性分别为94.78%（FaDRMa和FaDRMb）,97.40%（FaDRMa和FaDRMc）,97.17%（FaDRMb和FaDRMc）;氨基酸序列同源性分别为100%（FaDRMa和FaDRMc）,98.49%（FaDRMa和FaDRMb）。遗传进化分析将FaDRM与烟草（NtDRM1）和番茄（S1DRM5）的DRM划分到同一组。4.通过基因全序列与cDNA全序列比对发现FaMET1基因有2个内含子,FaDRM基因有10个内含子,符合典型的GT-AG剪接模式。同时发现FaDRM基因中存在选择性剪接现象,包括:3′端选择性剪接和内含子保留两种形式。5.建立了以总核酸为模板通过RT-PCR同时检测草莓RNA病毒和DNA病毒的简单快速技术体系,成功地检测出‘丰香’与‘全明星’微繁殖苗携带病毒种类。采用基于TaqMan探针的实时定量PCR技术,分析了‘丰香’和‘全明星’脱毒、带毒试管苗和脱毒、与带毒试管苗携带相同种类病毒的微繁殖一代苗中DNA甲基转移酶基因的表达,结果表明组培条件下,病毒会上调两类DNA甲基转移酶基因的表达。脱毒一代苗中两类DNA甲基转移酶基因的相对表达量都高于带毒一代苗中的相对表达量。6.采用基于TaqMan探针的实时定量PCR技术,分析了‘丰香’微繁殖苗及其后代中两类DNA甲基转移酶基因表达情况。表明两类DNA甲基转移酶基因表达趋势相同,其中在组织培养和移栽阶段表现出低表达,在微繁殖苗后代中得到恢复。7.利用半定量RT-PCR技术对‘寒富’苹果二倍体植株和秋水仙碱诱导的四倍体植株中两类DNA甲基转移酶基因表达进行分析。结果显示MET1基因在二倍体的幼嫩叶片中表达水平比四倍体植株略高（0.85/0.74）,而成熟叶片中表达水平差别很小。无论二倍体植株还是四倍体植株,MET1基因在幼嫩叶片中的表达水平都显著高于成熟叶片中的表达水平。DRM基因表达水平在四倍体与二倍体植株之间没有差异,而且幼嫩叶片和成熟叶片中的表达水平也基本一致。8.克隆得到FaMET1基因上游669 bp的调控区域和FaDRM基因上游901 bp的调控区域,用草莓DNA甲基转移酶基因启动子替换pCAMBIAl301上GUS基因的CaMV358启动子,分别构建了植物表达载体FMpro∷GUS和FDpro∷GUS。通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,GUS基因的瞬时表达结果表明克隆得到的草莓DNA甲基转移酶基因启动子片段具有启动子活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物DNA甲基化的建立和去甲基化
• 1.1.1 植物中5-甲基胞嘧啶的分布
• 1.1.2 植物中5-甲基胞嘧啶的含量
• 1.1.3 植物DNA甲基化作用方式
• 1.1.4 DNA去甲基化现象
• 1.2 植物DNA甲基化的功能
• 1.2.1 维持植物正常的生长发育
• 1.2.2 调节基因表达
• 1.2.3 维持基因组稳定性
• 1.2.4 DNA甲基化与植物春化作用
• 1.2.5 DNA甲基化与杂种优势
• 1.2.6 DNA甲基化与体细胞无性系变异
• 1.3 DNA甲基化的研究方法
• 1.3.1 MSAP
• 1.3.2 高效液相色谱法
• 1.3.3 亚硫酸盐测序
• 1.3.4 甲基化敏感的限制性内切酶结合Southern杂交分析法
• 1.4 植物DNA甲基转移酶及与甲基化有关的蛋白
• 1.4.1 MET1家族
• 1.4.2 CMT家族
• 1.4.3 DRM家族
• 1.4.4 DDM1
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二章 草莓和苹果DNA甲基转移酶基因片段的分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 草莓和苹果基因组DNA的提取及检测
• 2.1.3 引物设计
• 2.1.4 PCR反应
• 2.1.5 PCR特异DNA片段的回收
• 2.1.6 PCR产物克隆、测序
• 2.1.7 序列比对与分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 草莓和苹果基因组DNA的质量和完整性检测
• 2.2.2 草莓和苹果DNA甲基转移酶基因片段分离
• 2.2.3 MET1基因和DRM基因特异片段序列分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 克隆DNA片段的检测
• 2.3.2 DNA甲基转移酶基因的进化
• 2.4 小结
• 第三章 草莓DNA甲基转移酶基因全序列的分离
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 草莓基因组DNA和RNA的制备
• 3.1.3 引物设计
• 3.1.4 基因全长的获得
• 3.1.5 完整cDNA的获得
• 3.1.6 PCR特异DNA片段的回收
• 3.1.7 PCR产物克隆测序
• 3.1.8 序列比对与分析
• 3.1.9 Southern blot
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 草莓 DNA甲基转移酶基因全序列的获得
• 3.2.2 草莓 DNA甲基转移酶基因cDNA全序列的获得
• 3.2.3 草莓 DNA甲基转移酶基因拷贝数
• 3.2.4 DNA甲基转移酶基因序列分析
• 3.2.5 草莓 DNA甲基转移酶基因的内含子及选择性剪接
• 3.3 讨论
• 3.3.1 DNA甲基转移酶基因的分离方法
• 3.3.2 DNA甲基转移酶基因序列特性
• 3.4 小结
• 第四章 草莓 DNA甲基转移酶基因表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 总核酸和总 RNA提取
• 4.1.3 病毒检测
• 4.1.4 实时定量 PCR
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 病毒对草莓DNA甲基转移酶基因表达的影响
• 4.2.2 微繁殖对草莓DNA甲基转移酶基因表达的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 实时定量PCR偏差的克服方法
• 4.3.2 组培诱导的表观遗传变异及与DNA甲基化的关系
• 4.3.3 病毒对DNA甲基转移酶基因表达的影响
• 4.3.4 简化的草莓病毒检测体系的优点
• 4.4 小结
• 第五章 DNA甲基转移酶基因在二倍体与四倍体苹果中表达分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 基因组RNA提取和质量、纯度检测
• 5.1.3 半定量RT-PCR
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 半定量RT-PCR体系建立
• 5.2.2 DNA甲基转移酶基因在‘寒富’苹果二倍体与四倍体中的表达差异
• 5.3 讨论
• 5.3.1 苹果DNA甲基转移酶基因及其表达差异
• 5.3.2 半定量RT-PCR技术要点
• 5.4 小结
• 第六章 草莓FaMET1和FaDRM启动子的分离鉴定
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 基因组DNA提取和质量、纯度检测
• 6.1.3 启动子特异片段扩增
• 6.1.4 PCR特异DNA片段的回收
• 6.1.5 PCR产物克隆测序
• 6.1.6 序列分析
• 6.1.7 启动子表达载体的构建
• 6.1.8 农杆菌感受态细胞的制备、转化、阳性克隆的筛选
• 6.1.9 农杆菌侵染草莓果实及GUS活性检测
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 草莓DNA甲基转移酶基因启动子特异片段克隆和序列分析
• 6.2.2 GUS融合基因的构建
• 6.2.3 草莓DNA甲基转移酶基因启动子活性分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 GUS报告基因的优缺点
• 6.3.2 草莓DNA甲基转移酶基因转录活性
• 6.4 小结
• 第七章 结论与创新点
• 7.1 结论
• 7.2 创新点
• 7.3 下一步研究设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文