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秦艽转基因根植株诱导及其龙胆苦苷合成能力的分析

2020-12-08阅读(409)

秦艽转基因根植株诱导及其龙胆苦苷合成能力的分析

论文摘要

秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）为龙胆科（Gentianaceae）多年生草本植物,是我国的传统中药材,以根入药,具有抗风湿解热镇痛抑菌等作用。转基因根（transgenic root,TGR）,也叫发状根（hairy root,HR）,是植物受伤部位经发根农杆菌感染（Agrobaterium rhizogenes）后所诱导产生的一种根状器官。由于转基因根不仅可以经过组织培养再生出可能具有某种优良性状的转基因植株,也可以在液体悬浮培养条件些大量繁殖,并合成一些对人类有用的次生代谢产物,所以被公认为是一种有前途的生产有用次生代谢产物（包括药用成分）的新途径。由于近三分之一传统药材的药用部位是根,所以转基因根研究在传统药材生物药生产中具有更重要的意义。本研究利用本课题组张慧丽硕士两年前建立的秦艽转基因根,通过组织培养方法建立了相应的植株再生体系,探讨了不同激素浓度/组合对其植株再生能力的影响,分析再生植株形态学和龙胆苦苷合成能力。此外,还研究了多种物理化学因素对秦艽转基因根生物量和龙胆苦苷合成能力的影响。目的是探讨通过植株诱导获得一些高龙胆苦苷合成能力的新品系和通过液体悬浮培养大量合成龙胆苦苷及其他有用次生代谢产物的可能性。主要研究结果如下:（1）在含1.0 mg/l 2,4-D+0.5mg/1 6-BA的MS固体培养基上培养21天后,100%的TGR外植体均可诱导产生胚性愈伤组织。转移到无激素的MS固体培养基中14天后,高达94%的胚性愈伤组织可以产生1-12个芽点。经过两周的培养后,这些芽点可以发育成与种子苗一样的小苗。在室外,50%的再生植株可以存活。大部分在室外生长的再生植株与野生型植株相比,它们的叶子呈深绿色、叶面皱缩的椭圆形,气孔也较为小而密集;再生植株的叶子和根的重量分别比野生型植株的增加6倍和2倍。PCR分析证明这些再生植株的基因组内仍然保留Ri质粒中的rolC基因。HPLC分析结果表明再生植株的根中龙胆苦苷含量要比野生型高74.2%,但是叶子中的含量则要低12.9%。（2）分析不同理化因对转基因根生物量和龙胆苦苷合成的影响发现:（a）光照可以明显提高秦艽转基因根生物量和龙胆苦苷的含量。（b）其生物量累积随蔗糖浓度的升高呈先升后降的趋势,在30g/l时达到最大值;其龙胆苦苷单位含量则随蔗糖浓度的升高而总体呈上升趋势,在40和50g/l的时候达到最大。（c）低的铵/硝态氮比有利于其生长,随着铵/硝态氮比率的升高,其生物量累积随之减少。当培养基中只有铵盐的时候则完全抑制了它的生长,而其龙胆苦苷单位含量则随之升高。当铵盐由硫酸铵替换为硝酸铵（比率为0.825g/l:1.775g/l）时,最利于其生长,即其生物量累积和龙胆苦苷单位含量在此时都达到最高值。（d）在甘氨酸浓度为0时,秦艽转基因根也有一定量的生物量累积和龙胆苦苷的合成,但太高和太低的甘氨酸浓度都不利于其生物量的积累,当浓度为1.0mg/l时,生物量累积达到最大值;在甘氨酸浓度为0.5mg/l时,其龙胆苦苷单位含量达到最大。（e）由于秦艽转基因根合成龙胆苦苷的总量受生物量和单位含量的共同作用,因此,在本实验所设条件下,利用秦艽转基因根来合成龙胆苦胆时,最佳培养条件为:光照（16h/d,23001ux）,蔗糖30g/l,铵/硝态氮比（NH4NO3/KNO3）为0.825:1.775,甘氨酸1.0mg/l。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略表
  • 目录
  • 第一章 前言
  • 1.生物技术与药用植物有用次生代谢产物的生产
  • 1.1.植物细胞、组织培养
  • 1.2.植物转化
  • 1.2.1.发根农杆菌介导的植物转化
  • 1.2.2.根癌农杆菌介导的植物转化
  • 1.2.3.转基因根和冠瘿组织共培养
  • 1.2.4.其他
  • 2.利用转基因根生产次生代谢产物的影响因素
  • 2.1.物理因素
  • 2.1.1.光照
  • 2.1.2.温度
  • 2.2.化学因素
  • 2.2.1.碳源
  • 2.2.2.氮源
  • 2.2.3.氨基酸
  • 2.2.4.其他因素
  • 3.秦艽的研究现状和本实验的研究目的及意义
  • 第二章 材料与方法
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 2.1.秦艽转基因根植株再生及其形态学和龙胆苦苷合成的分析
  • 2.1.1.愈伤组织诱导和分化
  • 2.1.2.PCR鉴定
  • 2.1.3.转基因植株形态学和生物量分析
  • 2.1.4.龙胆苦苷的提取与测定
  • 2.2.理化因素对秦艽转基因根生长和龙胆苦苷合成的影响
  • 2.2.1.光照
  • 2.2.2.蔗糖浓度
  • 2.2.3.铵/硝态氮比
  • 2.2.4.甘氨酸浓度
  • 2.2.5.转基因根生物量的测定
  • 2.2.6.转基因根龙胆苦苷的提取和测定
  • 2.3.统计学分析
  • 第三章 实验结果
  • 1.供试转基因根形态学特征
  • 2.秦艽转基因根植株再生及其形态学和龙胆苦苷合成分析
  • 2.1.愈伤组织的形成和植株再生
  • 2.2.愈伤组织诱导率和芽的分化
  • 2.3.转基因植株的形态
  • 2.4.转基因植株的PCR鉴定
  • 2.5.转基因植株中的龙胆苦苷的积累
  • 3.理化因素对秦艽转基因根生长和龙胆苦苷合成的影响
  • 3.1.光照
  • 3.2.蔗糖浓度
  • 3.3.铵/硝态氮比
  • 3.4.甘氨酸浓度
  • 第四章 讨论
  • 1.秦艽转基因根植株再生及其形态学和龙胆苦苷含量分析
  • 2.理化因素对秦艽转基因根生长和龙胆苦苷合成的影响
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 研究生阶段发表和待发表的论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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