重组D-氨基酸氧化酶的表达、纯化与固定化

论文摘要

三角酵母D-氨基酸氧化酶（Trigonopsis variabilis D-Amino Acid Oxidase,TvDAAO）是生产制药中间体7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的一种具有重要工业价值的一种酶,用已经构建好Tv DAAO的表达载体pLHB-3在大肠杆菌中经乳糖导发酵表达,获得的菌体提取粗酶液,经以琼脂为基质的树脂FP-IDA-Co一步纯化后,于25℃,5%CPC条件下检测,每升发酵液的酶活为2900U,纯酶比活为16U/mg,纯化了16倍,纯酶的收率为70%。将DAAO纯酶液固定到环氧树脂AmberzymeTM上,固定化酶的酶活达到142U/g,能够连续10批转化底物而酶活没有明显损失,对底物的转化率达到98%以上。本文实验数据表明,DAAO经亲和层析后固定到环氧载体上可为其应用于工业当中提供很好的方法途经。 我们构建了透明颤菌血红蛋白（Vitreioscilla Hemoglobin,VHb）基因与TvDAAO基因的融合基因,来确认细菌血红蛋白能否作为固定化DAAO酶的氧供体从而提高DAAO酶活性。我们设计VHb的引物,并引入NcoI位点,用PCR方法扩增出VHb基因,将其克隆到pLHB-3中DAAO基因的前端获得表达载体pLX01,通过测序,序列正确,将pLX01与未融合VHb基因的pLHB-3质粒同时做诱导表达作对照,表达活性并没有明显提高。 为获得新的DAAO基因,用RT-PCR方法去从粘红酵母（Rhodotorula gracilis）中获得DAAO的cDNA并将其克隆到pRSET（A）载体上,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中,筛选到重组质粒pRSET-DAAO,抽取质粒转化pLysS/BL21（DE3）感受态细胞,得到重组大肠杆菌菌株LX02。在诱导温度为30℃,诱导菌株初始浓度为OD600=0.8,诱导剂IPTG浓度为1mM时,能够检测到DAAO活力。

论文目录

• 中文摘要
• 文中缩写
• 部分试剂的配置
• 综述
• 1.D-氨基酸氧化酶及其在自然界的分布
• 2.D-氨基酸氧化酶的催化机制
• 3.变异三角酵母的D-氨基酸氧化酶
• 3.1 生长和产酶
• 3.2 分离和纯化
• 3.3 酶学特性
• 3.4 稳定性和活性
• 4.D-氨基酸氧化酶的基因克隆和序列分析
• 5.D-氨基酸氧化酶基因的表达
• 6.D-氨基酸氧化酶的应用
• 6.1 1DAO酶促转化CPC为GL-7-ACA
• 6.2 DAO生物催化剂类型
• 7.酶促转化CPC成为7-ACA研究进展
• 第一章 三角酵母D-氨基酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化和固定化的研究
• 前言
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 提取含目的片段的质粒DNA
• 1.2.2 普通琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.3 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.4 DAO酶活力测定
• 1.2.5 以丙酮酸钠制备DAO测活标准曲线（25℃）
• 1.2.6 蛋白浓度测定
• 1.2.7 pLHB3表达质粒的构建（由实验室刘洪波构建）
• 1.2.8 pLHB-3在大肠杆菌中的发酵表达
• 1.2.9 DAAO的纯化和固定化酶的工艺研究
• 2.结果与讨论
• 2.1 pLHB3在大肠杆菌中的发酵表达
• 2.1.1 发酵过程中菌生长曲线
• 2.1.2 发酵过程中产酶曲线
• 2.1.3 乳糖的补加方式对产酶的影响
• 2.2 DAAO纯化结果
• 2.3 固定化DAAO的性质
• 2.3.1 固定化酶在4oC储存稳定性
• 2.3.2 固定化酶对CPC的转化
• 3.结论
• 第二章 三角酵母D-氨基酸氧化酶基因与血红蛋白基因在大肠杆菌中的融合表达的研究
• 前言
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 试剂和酶
• 1.2 方法
• 1.2.1 pLX01质粒的构建
• 1.2.2 PCR扩增VHb基因
• 1.2.3 载体pLHB3和目的DNA片段的限制性酶切
• 1.2.4 载体pLHB3的DNA片段与外源基因的连接和转化
• 1.2.5 重组质粒pLHB-VHb（pLX01）的鉴定
• 1.2.6 质粒pLX01在E.coli中的表达
• 2.结果与讨论
• 2.1 PCR扩增VHb基因
• 2.2 重组质粒pLHB-VHb（pLX01）的鉴定
• 2.3 质粒pLX01在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 3.结论
• 第三章 粘红酵母D-氨基酸氧化酶基因的克隆与表达
• 前言
• 1.材料与方怯
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 试剂和工具酶
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞总RNA的提取
• 1.2.2 pRSET质粒图谱及RT-PCR引物设计以及pRSET-RgDAAO的构建
• 1.2.3 RT-PCR扩增DAAO基因
• 1.2.4 载体pRSET目的DNA片段和外源基因的连接和转化
• 1.2.5 重组大肠杆菌菌株LX02的诱导表达
• 2.结果与讨论
• 2.1 细胞总RNA的提取及RT-PCR扩增DAAO基因
• 2.2 pMD18T-DAAO连接产物的PCR鉴定
• 2.3 重组质粒pRSET-DAAO的鉴定
• 2.4 DAAO的诱导表达
• 3.结论
• 英文摘要
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文独创性声明
• 学位论文版权的使用授权书