论文摘要
乙型肝炎病毒感染是全球主要的公共安全问题之一,国内有近10%的人口感染乙型肝炎病毒,感染者已超过1.2亿。药物在这类人群中的代谢规律是否跟正常人一致呢?是否会由于HBV感染影响药物的代谢,从而导致药物不良反应（药物性肝损害）的概率增加呢?这个问题一直是临床关注的热点,也是临床医学的一个盲区。肝脏是药物代谢的主要场所,肝脏进行药物代谢依赖于微粒体中的多种酶系,其中最重要的是细胞色素P450酶系。越来越多的证据表明,药物代谢过程所致肝损害与P450酶系密切相关,任何导致P450酶活性变化的因素都可以影响药物在体内的代谢,其中,遗传基因多态性和疾病的状况是公认的非常重要的因素。基因突变可以用来解释人们在服用药物时出现的药效学和药代学的个体差异,例如细胞色素P450亚家族CYP2C9酶,CYP2C9*2和CYP2C9*3突变基因能显著降低酶活性。另一个影响酶活性的因素是疾病的状况,对于慢性乙型肝炎患者而言,既往研究表明HBV可以对P450酶表达产生影响,但是HBV对P450酶各主要亚家族酶活力的影响是不一致的,而且先前的工作大部分都是在动物和细胞水平进行的,没有HBV感染影响人肝细胞色素P450表达的研究。由于CYP2C9在人类肝脏中含量丰富,占总量的20%,仅次于CYP3A,是肝内含量第二的CYP亚家族酶,能代谢大约16%不同性质的临床药物,并在前致癌物、前毒物和致突变剂的活化中起一定作用。既然CYP2C9酶在临床药物代谢中有如此重要的作用,那么慢性HBV感染时,CYP2C9酶的活性是如何变化以及影响酶变化的机制是什么呢?这是我们关注的重点。本实验选取CYP2C9酶作为研究对象,收集临床肝脏标本,检测慢性HBV感染肝组织和无HBV感染的肝组织中CYP2C9酶的活性,并检测该酶在mRNA水平和蛋白水平变化情况,同时在细胞水平对临床研究结果进行机制的探讨,为慢性HBV感染患者安全合理使用药物、规避不良反应提供科学依据。一、细胞色素P450 2C9基因多态性研究目的检测CYP2C9基因型,排除CYP2C9*2和*3突变等位基因对CYP2C9酶活性的影响,为下一步研究奠定基础。方法收集慢性HBV感染患者和无HBV感染者的肝组织和血液标本20例,以基因组DNA提取试剂盒提取血液基因组DNA,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术对CYP2C9进行基因分型,并随机抽取数例样本进行TA克隆测序验证。结果提取的血液基因组DNA光密度值在1.8～1.9之间,含量为90ng/μl～230ng/μl,琼脂糖凝胶电泳提示基因组完整,PCR-RFLP分析发现20例均为野生型CYP2C9（*1*1）,未检测到基因突变,TA克隆测序分析验证了PCR-RFLP分析结果。结论本实验中我们未检测到CYP2C9突变基因,CYP2C9基因多态性的种族差异与地域不均衡性是结果最可能的解释,但是为我们下一步检测疾病对CYP2C9酶活性的影响奠定了基础。二、慢性乙型肝炎病毒感染对人肝细胞色素P450 2C9的影响目的探讨慢性HBV感染对人肝脏细胞色素酶2C9表达的影响,为慢性HBV感染患者安全用药提供理论指导。方法慢性HBV感染患者和无HBV感染者的肝组织样本,匀浆后差速离心法制备肝脏微粒体酶混合物（S9）,以甲苯磺丁脲为探针,用高效液相色谱（HPLC）的方法检测两组样本CYP2C9酶的活性,同时以RT-PCR和western blot测定两组肝组织样本中mRNA和蛋白表达的差异。结果高效液相色谱显示慢性HBV感染组Vmax为40.4±10.4 pmol·mg-1·min-1,而无HBV感染对照组Vmax为52.6±13.4pmol·mg-1·min-1,两组之间差异有统计学意义（P=0.0367）,,慢性HBV感染组和对照组米氏常数（Km）分别为263.5±66.4μmol/L和284.6±85.9μmol/L,两组间差异无统计学意义（P=0.5471）,RT-PCR和western blot显示慢性HBV感染组CYP2C9 mRNA和蛋白的表达也较对照组明显下降（0.39±0.28 vs 0.65±0.13,0.26±0.13 vs 0.60±0.19）,差异均有统计学意义（P=0.0171,P=0.0002）。结论慢性HBV感染可以在mRNA和蛋白水平降低肝脏CYP2C9酶的表达,导致酶活性下降,慢性HBV感染对CYP2C9酶活性的抑制作用是非竞争性的,对酶的结构未造成影响。三、乙型肝炎病毒X蛋白对细胞色素P450 2C9诱导的影响目的探讨慢性HBV感染影响CYP2C9表达调控的机制,为临床合理用药提供理论依据。方法培养HepG2细胞,选用利福平作为诱导剂,以MTT法检测不同浓度的利福平对HepG2细胞的毒性作用,将乙型肝炎病毒X基因（HBX）插入pEGFP-N1中,构建了pEGFP-X真核表达质粒,将pEGFP-X和pEGFP-N1（转染对照）转染HepG2细胞,同时以利福平作为诱导剂,诱导HepG2细胞CYP2C9表达72小时,分别用RT-PCR和western blot方法,在mRNA和蛋白水平观察HBx对利福平诱导CYP2C9表达的影响。结果MTT法检检测提示5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L和50μmol/L利福平对于HepG2细胞均无细胞毒性,利福平能很好诱导CYP2C9的表达,pEGFP-N1利福平诱导组和pEGFP-X利福平诱导组mRNA诱导表达量分别是空白细胞对照组的224%和163%,蛋白表达量分别是对照组的300%和245%,pEGFP-N1利福平诱导组和pEGFP-X利福平诱导组mRNA表达量分别为0.387±0.015和0.282±0.032,差异有统计学意义（P＜0.05）;两组蛋白表达量分别为1.594±0.149和1.299±0.073,也有统计学差异（P＜0.05）。结论HBX可以干扰利福对HepG2细胞CYP2C9的诱导,提示慢性HBV感染导致的CYP2C9活性降低以及mRNA、蛋白表达的下降可能是由于HBX在人肝细胞中表达,干扰了CYP2C9表达所致。小结:本课题通过收集慢性HBV感染患者和无HBV感染者的肝组织和血液标本,采用PCR-RFLP方法检测CYP2C9酶的基因多态性,以甲苯磺丁脲为探针底物,用HPLC方法检测两组肝组织样本中CYP2C9的酶活性。以RT-PCR和western印迹法测定了两组肝组织样本中mRNA和蛋白的表达差异,证实了慢性HBV感染患者CYP2C9酶活性较无HBV感染者明显下降,同时探讨了这一现象的机制,发现HBx可以干扰利福平对CYP2C9的诱导,提示HBX对CYP2C9的表达调控有抑制作用,这一发现对于临床患者安全合理用药、规避不良反应提供了一定的指导作用。
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