盐芥TsVP启动子核心区域的鉴定及其上游调控蛋白的功能分析

盐芥TsVP启动子核心区域的鉴定及其上游调控蛋白的功能分析

论文摘要

对高等植物非生物胁迫应答的分子机制的研究具有重要的意义。拟南芥是一种典型的甜土植物,它在耐盐耐早机制研究方面有其自身的局限性。盐芥是拟南芥的近缘种,是一种高度耐盐耐旱的盐生植物,且具有基因组小,cDNA序列与拟南芥相似程度高等优点,已成为人们研究植物非生物胁迫响应的模式植物。基因表达调控发生在染色体、转录、转录后、翻译、翻译后多个水平上,其中转录水平的调控尤为重要。启动子作为控制基因转录的顺式作用因子调控基因转录的起始,在基因表达调控中发挥重要作用,而且其调控作用的实施需要转录因子蛋白的参与。本研究以盐芥液泡焦磷酸酶基因TsVP的启动子为实验材料,通过对该启动子核心元件的鉴定及其上游结合蛋白的功能分析,揭示了TsVP基因对盐胁迫诱导响应的部分机制。本实验室高峰等发现,尽管在酵母和烟草中过表达TsVP和AVP1都可以提高宿主的耐盐性,但它们在盐胁迫条件下表达模式不同:TsVP的表达受盐胁迫诱导,而AVP1则对盐诱导不发生反应。为了研究造成这种差异的原因,本工作克隆出这两个基因的启动子区域并进行生物信息学分析,发现二者在顺式作用元件的种类,数量以及分布存在明显的差异。为了较深入了解TsVP启动子的结构和特性,构建了一系列的5’端缺失突变体,将它们分别与报告基因gus连接,用于转化拟南芥。在转基因拟南芥中,全长TSVP启动子(2200bp)在正常条件下高强度启动报告基囚的表达,其GUS表达强度与CaMV 35S启动子驱动的GUS表达强度差异不大;在盐胁迫下,其GUS表达活性在根部和叶中受到明显的诱导作用,升高到未胁迫时的3倍左右。PT1(全长TsVP启动子连接GUS报告基因)和PA1(全长AVP1启动子连接GUS报告基因)在正常生长条件下具有相似的表达模式,几乎在种子外的每一个组织中都具有活性。但在盐胁迫处理后,PT1在根、叶中的表达受到明显的诱导,在根部高强度表达主要出现在根尖处,而在PA1中未发现这种诱导现象。PT1启动子的高驱动能力表明该启动子在植物基因工程中有很好的应用价值。在5’系列缺失突变体中,PT2与PT1相比缺少了一段856bp的区域(-2200至-1344),导致PT2的活性要明显低于PT1的,我们推测在-2200到-1344这段区域存在着可以明显提高启动子活性的增强子元件。此外,PT2在花中表现出明显的花药特异性表达模式。这种表达模式同样出现在缺失突变体PT3到PT6的转基因植株中,但在PT7到PT9中消失。我们推测一个AAATGA元件可能在花的花药特异表达模式中起关键作用。通过对系列缺失突变体在正常条件以及盐胁迫条件下的GUS基因表达分析,最终鉴定得到一段130bp(-667至-538)的核心序列。该序列对于TsVP启动子的盐胁迫诱导响应具有重要的作用。农杆菌介导的烟草叶片GUS瞬时表达分析也表明这130bp区域可以很好的响应盐胁迫环境。在该区域尚未发现与盐胁迫响应相关的已知作用元件,因此对该区域进行进一步分析,找到其中存在的核心序列,并找到调控该元件的功能蛋白,无疑具有重要的学术意义。以这段核心序列为诱饵,通过酵母单杂交系统筛选得到了与之相互作用的两个蛋白,命名为TsNacl和TsVOZ1。TsNac1的ORF全长918bp,与拟南芥RD26(AT4G27410)具有86%的核苷酸相似性,92%的氨基酸相似性。RT-PCR检测表明,TsNac1基因在正常生长条件下的表达量在根中远小于叶中的,但在盐胁迫、干旱胁迫和ABA处理后,根中表达量的变化幅度高于叶中的。TsNac1基因的表达受盐胁迫、干旱胁迫和ABA胁迫的诱导。在这三种胁迫条件下该基因表达强度的变化幅度有不同,对ABA诱导的响应最明显,尤其是在根中,处理12小时后其表达量上升了1000多倍。在盐胁迫条件下TsNac1基因的表达水平可上调60多倍,而对干旱诱导的响应相对较弱,尤其在叶中。这些结果表明该基因有可能是盐芥耐盐机制的重要成员,与ABA信号传导有重要联系。构建TsNac1原核表达载体并转化大肠杆菌BL21,诱导转化菌表达重组蛋白。利用已获得的TsNac1重组蛋白,与上述130bp的启动子序列进行体外结合试验。EMSA试验的结果表明,TsNac1蛋白可以很好的与该片段在体外结合,而且这种结合具有良好的特异性。鉴于TsNac1与TsVP启动子中的盐诱导响应区域特异性结合,而且其本身的表达受到盐、干旱以及ABA的诱导,推测TsNac1很可能就是我们要寻找的调控TsVP表达的上游转录因子,对其进行深入研究以揭示TsNac1的生物学功能以及其调控的下游基因网络具有重要的意义。通过在拟南芥中过表达和抑制表达TsNac1,初步分析了该基因在植物耐盐性方面的作用。TsNac1基因的过表达提高了转基因拟南芥的耐盐性,而抑制该基因则明显增加了转基因拟南芥的盐敏感性。鉴定TsNac1在TsVP启动子上的结合位点可以为了解其作用机制提供有价值的参考资料,也可以为植物基因工程改良提供具有使用价值的启动子元件,因此鉴定TsNac1在TsVP启动子上的靶位点具有重要的意义。利用不同的过量非标记竞争性DNA来竞争标记DNA与TsNac1蛋白的结合,鉴定出一段20bp的DNA序列(GAATATACCATGGA TAAGC A)为该蛋白的结合位点。在这段DNA序列中包含CATG元件。目前认为NAC家族蛋白的结合位点为CACG,但是Trans等研究表明拟南芥中NAC家族的蛋白也可结合一段MYC-like CATGTG位点。推测CATG可能是TsNac1蛋白结合的核心位点,其结合也需要周围的几个甚至十几个核苷酸序列。利用CHIP-on-chip技术对该蛋白在拟南芥染色体中的结合位点进行了详细的分析,并利用RT-PCR对实验结果进行了验证。结果表明在拟南芥中该蛋白与284个基因的启动子区域有结合作用,这284个基因参与了众多的生物学过程,包括了代谢,发育,细胞定位,刺激响应,生殖,蛋白磷酸化,氧化还原等生物学过程。值得注意的是在这284个基因中,有大约70个属于转录因子类基因,占25%左右,而拟南芥中转录因子只占全部基因数量的5%左右。也就是说在TsNac1的靶基因中,转录因子所占的比例大概是正常比例的5倍,而且其靶基因中包括了像DREB这种公认的与植物抗逆有关的转录因子,这也表明在TsNac1基因在植物抗逆中的重要调控作用。此外该基因还可以通过调节一些小分子转运体基因,结构基因以及一些结合蛋白基因的表达来调控下游功能基因的表达,而且该基因也可以直接调控一些功能基因的表达水平。这些结果表明TsNac1在基因调控网络中应该处于一个较为上游的位置。此外,TsVP在拟南芥中的同源基因AVP1并不在这些靶基因中,通过前面启动子分析的工作我们知道AVP1虽然属于抗逆相关基因,但是其本身的表达并不受盐胁迫的诱导,这一结果表明TsNac1并没有参与AVP1基因的调控,这与我们的预期是相符合的。另外,利用酵母单杂交系统还鉴定出与基于TsVP启动子构建的诱饵相结合的TsVOZ1蛋白。该蛋白与拟南芥中的AVOZ1具有85%的核苷酸相似性,90%的氨基酸相似性,其表达受盐胁迫的诱导,但是却不受干旱以及ABA的诱导,而且其受盐胁迫响应的程度远不如TsNac1明显。根据Mitsuda N等人对AVOZ1的研究结果,我们在TsVP启动子区域中,我们找到了一段GCGTNx7ACGC回文序列,即GCGTCGGCTGCACGC (-274到-259),但是这段序列并不在上述我们鉴定得到的130bp核心序列中。通过在拟南芥中对TsVOZ1基因进行过表达和抑制表达,得出TsVOZ1的过表达以及基因敲除并没有明显影响转基因拟南芥的耐盐性。TsVOZ1虽然与该启动子有结合,然而并没有参与该基因盐胁迫响应的调控。这些工作通过对盐芥中TsVP启动子及其上游调控蛋白的功能分析,不仅为植物基因工程提供具有自主知识产权的调控元件和耐盐基因,而且为植物盐胁机制的深入探讨提供了新资料,可望为我国大面积盐碱地的开发利用做贡献。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 符号说明
  • 第一章 前言
  • 1.1 启动子的概念和分类
  • 1.1.1 启动子的概念
  • 1.1.2 启动子的分类
  • 1.1.2.1 组成型启动子
  • 1.1.2.2 组织特异型启动子
  • 1.1.2.3 诱导型启动子
  • 1.2 转录因子的概念和分类
  • 1.2.1 转录因子的概念
  • 1.2.2 转录因子作用的分子机理
  • 1.2.3 植物逆境相关的转录因子
  • 1.2.3.1 WRKY类转录因子
  • 1.2.3.2 bZIP类转录因子
  • 1.2.3.3 MYB类转录因子
  • 1.2.3.4 AP2/EREBP类转录因子
  • 1.2.3.5 NAC类转录因子
  • 1.3 盐芥的研究进展
  • 1.3.1 盐芥和拟南芥在盐胁迫条件下转录物组变化的比较
  • 1.3.2 盐芥是耐盐耐旱研究的模式植物
  • +-PPase研究进展'>1.4 H+-PPase研究进展
  • +-PPase基因的克隆'>1.4.1 H+-PPase基因的克隆
  • +-PPase基因表达和活性水平的调控'>1.4.2 H+-PPase基因表达和活性水平的调控
  • 1.4.3 TsVP基因的研究进展
  • 1.5 核酸—蛋白质互作的生物化学研究方法
  • 1.5.1 体外结合分析方法
  • 1.5.1.1 硝化纤维膜过滤实验
  • 1.5.1.2 足迹法
  • 1.5.1.3 电泳迁移率变动实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)
  • 1.5.1.4 Southwestern杂交
  • 1.5.2 体内研究方法
  • 1.5.2.1 非变性染色质免疫沉淀(nChIP)
  • 1.5.2.2 变性(交联)染色质免疫沉淀(xChIP)
  • 1.5.2.3 Re-ChIP
  • 1.5.2.4 ChIP Chop
  • 1.5.2.5 ChIP-on-chip (Chromatin immuno-precipitation based on microarray)
  • 1.6 本工作的目的和意义
  • 第二章 盐芥TsVP启动子中盐诱导响应核心区域的鉴定
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.1.1 植物材料及培养条件
  • 2.1.1.2 菌株和质粒载体
  • 2.1.1.3 培养基及药品试剂
  • 2.1.2 试验方法
  • 2.1.2.1 质粒的重组和转化
  • 2.1.2.2 启动子的生物信息学分析以及缺失体的构建
  • 2.1.2.3 拟南芥的转化和筛选
  • 2.1.2.4 转基因拟南芥的分子生物学检测和组织化学分析
  • 2.1.2.5 核心区域在烟草中的瞬时表达分析
  • 2.2 实验结果与分析
  • 2.2.1 启动子序列信息学分析
  • 2.2.2 缺失突变体的构建
  • 2.2.3 转基因拟南芥的筛选以及PCR鉴定
  • 2.2.4 PT1转基因拟南芥的组织化学分析
  • 2.2.5 PT2--PT9转基因拟南芥的组织化学分析
  • 2.2.6 130bp序列的功能验证
  • 2.2.7 130bp序列的生物信息学分析
  • 2.3 讨论
  • 第三章 TsNac1和TsVOZ1的克隆和功能分析
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 实验方法
  • 3.1.2.1 质粒的重组和转化方法
  • 3.1.2.2 构建酵母单杂交所用质粒
  • 3.1.2.3 盐芥RNA的分离
  • 3.1.2.4 盐芥cDNA合成
  • 3.1.2.5 酵母菌株Y187的遗传转化
  • 3.1.2.6 酵母质粒提取
  • 3.1.2.7 阳性酵母质粒转化大肠杆菌
  • 3.1.2.8 TsNac1和TsVOZ1基因全长的克隆
  • 3.1.2.9 TsNac1和TsVOZ1蛋白原核表达
  • 3.1.2.10 盐芥总蛋白及核蛋白的提取
  • 3.1.2.11 凝胶阻滞试验测定目的蛋白与DNA结合活性
  • 3.1.2.12 Real-time RT-PCR分析TsNac1和TsVOZ1在盐芥中的表达模式
  • 3.1.2.13 植物过表达载体以及干扰载体的构建
  • 3.1.2.14 拟南芥和盐芥的遗传转化与筛选
  • 3.1.2.15 转基因材料耐盐性分析
  • 3.1.2.16 抗体制备和Western blotting检测
  • 3.1.2.17 统计学分析
  • 3.2 实验结果与分析
  • 3.2.1 诱饵质粒的构建
  • 3.2.2 盐芥cDNA表达文库的制备
  • 3.2.3 利用酵母单杂交试验筛选目的蛋白
  • 3.2.3.1 cDNA表达文库质量的测定
  • 3.2.3.2 盐芥cDNA表达文库的筛选
  • 3.2.4 TsNac1和TsVOZ1全长基因的克隆及生物信息学分析
  • 3.2.5 TsNac1和TsVOZ1的表达分析
  • 3.2.6 TsNac1和TsVOZ1的原核表达
  • 3.2.6.1 TsNac1和TsVOZ1的原核表达载体的构建
  • 3.2.6.2 TsNac1原核表达蛋白的诱导与纯化
  • 3.2.6.3 TsVOZ1原核表达蛋白的诱导与纯化
  • 3.2.7 TsNac1重组蛋白与TsVP启动子中130bp序列的体外结合
  • 3.2.8 抗体的制备
  • 3.2.9 植物表达载体的构建
  • 3.2.10 转基因拟南芥和转基因盐芥的产生
  • 3.2.11 转基因拟南芥的耐盐性分析
  • 3.3 讨论
  • 第四章 转录因子TsNac1调控基因的鉴定与初步分析
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.2 实验方法
  • 4.1.2.1 CHIP-on-chip分析
  • 4.1.2.2 凝胶阻滞实验
  • 4.1.2.3 Real-time RT-PCR验证CHIP-on-chip实验结果
  • 4.2 实验结果
  • 4.2.1 TsNac1在TsVP启动子中的结合位点鉴定
  • 4.2.2 TsNac1蛋白的CHIP-on-chip结果分析
  • 4.2.3 TsNac1蛋白部分靶基因的分析及实验结果验证
  • 4.2.4 TsNac1蛋白部分靶基因的功能聚类分析
  • 4.2.5 部分TsNac1蛋白结合基因的功能分析
  • 4.2.5.1 具有转运体活性的蛋白
  • 4.2.5.2 具有催化活性的蛋白
  • 4.2.5.3 具有结构分子功能的蛋白
  • 4.2.5.4 具有转录调控活性的蛋白
  • 4.2.5.5 具有结合功能的蛋白
  • 4.3 小结与讨论
  • 结语与展望
  • 参考文献
  • 附录1 异源过表达TsH3.1基因可以显著促进烟草的生长
  • 附录2 本实验中新克隆得到的基因序列
  • 在读期间发表论文以及申请专利
  • 致谢
  • 学位论文评阅及答辩情况表
  • 相关论文文献

    • [1].转TsVP基因玉米抗旱性鉴定研究[J]. 生物技术进展 2013(03)

    标签:;  ;  

    盐芥TsVP启动子核心区域的鉴定及其上游调控蛋白的功能分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢