Osmolytes在精氨酸激酶去折叠和再折叠过程中的保护作用

论文摘要

精氨酸激酶（ATP: N-精氨酸磷酸转移酶EC 2.7.3.3）是无脊椎动物中参与能量代谢的一种重要磷酸激酶。目前精氨酸激酶已被广泛用于蛋白质折叠的研究。Osmolytes主要包括各种多羟基化合物、糖类、有机溶剂和多种氨基酸以及它们的衍生物,osmolytes在蛋白质折叠的过程中可以起到稳定蛋白结构、诱导正确构象的作用。但是,osmolytes对精氨酸激酶在盐酸胍中去折叠和再折叠过程的保护作用仍未见报道。本文研究目的是在分子水平上力图阐明osmolytes保护蛋白质抵抗胍变性的机理。本文以东亚飞蝗（Migratoria manilensis）的精氨酸激酶为研究对象,应用分子筛凝胶过滤、离子交换层析等生物化学的方法,从蝗虫肌肉组织里分离纯化了精氨酸激酶。重点利用酶活性检测、内源荧光以及ANS荧光光谱等手段对精氨酸激酶在盐酸胍溶液中的变性机理以及四种osmolytes——脯氨酸、蔗糖、DMSO和甘油对精氨酸激酶的保护作用进行了研究。实验结果表明:osmolytes以浓度依赖的方式降低精氨酸激酶失活和去折叠速度,降低精氨酸激酶在盐酸胍溶液中的失活速率常数ki,提高过渡态自由能的变化值??Gi,提高精氨酸激酶在盐酸胍溶液中去折叠的Cm值以及稳定酶的活性构象。对于精氨酸激酶的再折叠过程中osmolytes的防聚沉作用的研究表明:osmolytes的加入会使胍变性精氨酸激酶复性过程中的聚沉量大大降低,诱导正确的折叠方式。所有结果暗示着osmolytes不仅是动植物体内能量代谢物质和有机组分,而且具有维持蛋白质功能的重要生理意义,特别是在极端环境下,能够维持蛋白质的活性,保护蛋白免受环境影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 1 引言
• 1.1 蛋白质折叠
• 1.1.1 蛋白质折叠研究的意义
• 1.1.2 蛋白质折叠研究的概述
• 1.1.3 蛋白质折叠的研究方法和技术手段
• 1.1.4 蛋白质折叠的主要假说和模型
• 1.1.5 蛋白质去折叠的研究
• 1.2 精氨酸激酶的研究背景
• 1.3 本论文的主要研究工作
• 2 材料与方法
• 2.1 实验试剂、材料及仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 溶液的配制
• 2.2.2 AK 的纯化
• 2.2.3 AK 浓度和活力的测定
• 2.2.4 osmolytes 对 AK 在 GdnHCl 溶液中失活的保护实验
• 2.2.5 osmolytes 对 AK 在 GdnHCl 溶液中去折叠的保护实验
• 2.2.6 osmolytes 对胍变性 AK 再折叠过程中防聚沉的实验
• 3 结果与分析
• 3.1 AK 的分离纯化结果
• 3.2 osmolytes 对 GdnHCl 中的 AK 活力的保护作用
• 3.2.1 脯氨酸对 GdnHCl 溶液中的 AK 活力的保护作用
• 3.2.2 蔗糖对 GdnHCl 溶液中的 AK 活力的保护作用
• 3.2.3 DMSO 对 GdnHCl 溶液中的 AK 活力的保护作用
• 3.2.4 甘油对 GdnHCl 溶液中的 AK 活力的保护作用
• 3.3 osmolytes 对 GdnHCl 溶液中的 AK 折叠结构的保护作用
• 3.3.1 脯氨酸对 AK 折叠结构的保护作用
• 3.3.2 蔗糖对 AK 折叠结构的保护作用
• 3.3.3 DMSO 对 AK 折叠结构的保护作用
• 3.3.4 甘油对 AK 折叠结构的保护作用
• 3.3.5 外源荧光探针法研究 osmolytes 对 AK 构象的保护作用
• 3.4 osmolytes 防止 AK 聚沉的研究
• 4 讨论
• 4.1 osmolytes 对 AK 活力与构象的保护作用
• 4.2 osmolytes 在胍变性的 AK 再折叠过程中防聚沉的作用
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文