油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究

论文摘要

油菜是重要的油料作物,种子的含油量占其干重的35%-45%。菜油也是非常好的食用油,含有丰富的脂肪酸。菜油也是重要的工业原料,是我国发展生物柴油的理想的原料来源之一。因此大力发展油菜,提高油菜含油量,不仅能为我国能源安全战略作出重要贡献,还将有助于保障我国的粮食安全,促进农民增收,具有十分重要的战略意义。然而,油菜经常受到高盐、干旱、低温和营养缺乏（如低磷、低钾）等不良非生物胁迫的严重破坏,造成油菜产量严重下降。通过基因工程手段将一些具有抗逆功能的基因导入植物基因组进而获得抗逆新品种,这为传统育种模式的改革带来了新的契机。与拟南芥、水稻等传统模式植物相比,油菜中抗逆基因的鉴定和抗逆机制的研究还比较少。因此,筛选和鉴定油菜中与抗逆相关的基因,分析揭示其抗逆分子机制,可以为通过基因工程手段来改良油菜抗逆性提供了新的科学依据。本研究采用Macroarray技术,从油菜cDNA文库中筛选了参与高盐、干旱胁迫应答的基因,并对一些感兴趣的目标基因进行了深入的研究。主要结果如下：1.通过Macroarray技术从油菜cDNA文库中筛选鉴定参与高盐、干旱胁迫应答的基因采用Macroarray技术,从油菜cDNA文库中共筛选得到313个参与盐胁迫应答的基因（172个受到高盐胁迫的诱导,141受到高盐胁迫的抑制表达）；477个参与干旱胁迫应答的基因（288个受到干旱胁迫的诱导,189个受到干旱胁迫的抑制表达）；154个基因受到高盐和干旱两种胁迫的双重诱导；104个基因受到高盐和干旱两种胁迫的抑制表达。这也说明高盐胁迫和干旱胁迫之间存在着共同的调控系统或信号交叉。2.高盐干旱胁迫应答基因的表达模式分析从上述胁迫诱导表达的候选基因中选取了13个基因做进一步的研究。这些基因编码的蛋白分属于六个蛋白家族：蛋白激酶家族（MAPKKK和CIPK）、金属硫蛋白家族、生长素应答或抑制蛋白家族、脂类转运蛋白、直接和胁迫相关的蛋白、代谢酶类。实时定量RT-PCR分析了这13个基因在盐胁迫、干旱胁迫的表达模式,同时也分析了6个基因在ABA处理下的表达模式。结果如下：13个基因中,有7个基因的表达受到盐胁迫的诱导；12个基因的表达受到甘露醇（模拟干旱胁迫）的诱导,其中包括6个受盐胁迫诱导的基因；进一步的研究揭示5个受干旱胁迫诱导的基因也受ABA的显著诱导。这些结果进一步表明干旱和高盐胁迫信号、干旱与ABA信号通路之间存在着交叉。组织表达分析结果显示,这13个基因可能在油菜的不同组织器官发育中也发挥着重要的作用。3.冷调节基因BnCOR25的表达分析及功能鉴定我们从候选的288个干旱诱导的基因中,鉴定了一个新型的编码冷调节蛋白的基因,该基因编码蛋白的分子量为25KD,因此我们将其命名为BnCOR25 （GeneBank号为HM187577）。实时定量RT-PCR结果显示BnCOR25基因主要在下胚轴、子叶、茎和花中表达,但是在根和叶子中表达量较低。Northern杂交证实BnCOR25基因的表达受到干旱和冷胁迫的显著诱导。研究结果还揭示BnCOR25基因的表达是受ABA信号通路调节的。BnCOR25蛋白主要定位于细胞膜上和细胞质中。过量表达BnCOR25基因增强了裂殖酵母细胞在冷胁迫下的存活率；过量表达BnCOR25的转基因拟南芥增强了对冷胁迫的耐受性。这些结果暗示该基因可能在赋予植物对冷胁迫耐受性中起一定的作用。4. BnCIPK6基因的表达鉴定和启动子活性分析在154个受干旱和高盐胁迫诱导的候选基因中,其中有一个基因编码的蛋白和拟南芥CIPK蛋白激酶家族的成员CIPK6有很高的同源性,因而被命名为BnCIPK6。BnCIPK6基因的表达受到高盐胁迫、渗透胁迫、低磷胁迫、ABA和BL的显著诱导。组织表达分析结果显示,BnCIPK6基因主要在花中表达,在子叶中适度表达,而在其它组织中表达水平较低。我们分离得到了约850bp长度的BnCIPK6启动子片段,组织化学染色分析揭示12天苗龄的拟南芥小苗,下胚轴和子叶中均有很强的GUS信号,而在其它组织中很弱或者检测不到GUS信号；胁迫处理分析揭示BnCIPK6基因的启动子是受高盐、渗透胁迫、ABA和BL诱导的。5. BnCIPK6互作蛋白的筛选及鉴定酵母双杂交结果显示BnCIPK6可以与拟南芥的CBL1,CBL2, CBL3和CBL9发生相互作用。将BnCIPK6蛋白作为诱饵蛋白筛选油菜cDNA文库,得到27种与其相互作用蛋白,这些互作蛋白涉及到植物生长发育、代谢及信号转导等多个方面。其中包括两个CBL蛋白,分别与AtCBL1和AtCBL3蛋白同源,我们将和AtCBL1同源性较高的油菜CBL蛋白,命名为BnCBL1, BiFC实验也证明了BnCIPK6和BnCBLl蛋白在体内的相互作用。6. BnCIPK6和BnCBL1蛋白的亚细胞定位及BnCIPK、BnCIPK6T182D蛋白的体外磷酸化分析亚细胞定位研究显示BnCIPK6蛋白在细胞膜、细胞质及细胞核中均有分布,而BnCBL1蛋白定位于细胞膜上。体外激酶磷酸化分析揭示点突变的BnCIPK6T182D蛋白-BnCIPK6（M）,相对BnCIPK6蛋白自磷酸化能力更强,表明182位的苏氨酸残基是蛋白激活的关键位点。7. BnCIPK6、BnCIPK6（M）及BnCBL1过量表达转基因拟南芥均显著增强了对盐胁迫、低磷胁迫的耐受性为研究BnCIPK6及BnCBLl基因的功能,我们分别构建了BnCIPK6、BnCIPK6（M）及BnCBLl过量表达载体并转化了拟南芥,筛选获得转基因植株。分别选取这些外源基因在拟南芥中表达量较高的纯合株系做表型分析及功能研究。结果显示BnCIPK6、BnCIPK6（M）及BnCBL1转基因拟南芥均显著增强了对盐胁迫、低磷胁迫的耐受性。结果说明BnCBL1-BnCIPK6可能通过功能性的相互作用来参与植物对高盐、低磷胁迫的应答。8. BnCIPK6和BnCIPK6（M）的过量表达转基因拟南芥增强了对ABA的敏感性我们分析了转基因植株对ABA的应答,结果显示BnCIPK6和BnCIPK6（M）的过量表达转基因拟南芥均增强了对ABA的敏感性,尤其是后者显示出了对ABA的超敏性。ABA相关的Marker基因包括RD29A, ABF3, ABF4在ABA处理后的BnCIPK6（M）的转基因拟南芥中的表达量显著升高。而我们并未观察到过量表达BnCBLl的转基因拟南芥对ABA应答的改变。上述结果表明BnCIPK6参与了对ABA的应答,而BnCBL1没有参与ABA的应答,暗示可能存在和BnCIPK6相互作用的其它CBL蛋白,参与并介导了对ABA的应答。9. BnCIPK6（M）的过量表达转基因拟南芥植株对BR应答改变,且提高了对BR合成抑制剂BRZ的敏感性BnCIPK6（M）过量表达转基因植株改变了对油菜素内酯（BR）的应答,提高了对BRZ的敏感性。而我们并未观察到BnCIPK6和BnCBLl过量表达转基因拟南芥对BR应答表型的改变。这说明激活形式的BnCIPK6可能参与了BR的信号,同样暗示可能存在和BnCIPK6相互作用的其它CBL蛋白,参与并介导了对BR的应答。10.拟南芥cipk6功能缺失突变体减弱了对ABA的应答、对盐胁迫和低磷胁迫更加敏感对拟南芥cipk6功能缺失突变体的研究发现,cipk6突变体对盐胁迫和低磷胁迫更加敏感,对ABA的敏感性下降,这也说明AtCIPK6基因参与了对盐、低磷胁迫及ABA的应答。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

1.1 植物在各种非生物逆境胁迫下的应答、调节途径

1.1.1 植物体内非生物胁迫信号传递的一般途径

1.2 植物抗逆过程相关的功能基因

+/H⁺转运蛋白基因'>1.2.1 Na⁺/H⁺转运蛋白基因

1.2.2 渗透调节相关基因

1.2.3 细胞抗氧化相关基因

1.2.4 水通道蛋白

1.3 植物抗逆境信号过程中的调节基因

1.3.1 信号转导相关基因

1.3.2 逆境相关的转录因子

1.4 立题依据和研究意义

第二章油菜高盐、干旱胁迫应答基因分离鉴定和表达分析

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种和质粒

2.1.3 化学试剂及其它材料

2.1.4 常用培养基

2.1.5 PCR扩增引物及试剂

2.2 实验器材

2.3 实验方法

2.3.1 油菜无菌苗的培养及材料的收取

2.3.2 cDNA分离以及Macroarray分析

2.3.3 DNA测序分析

2.3.4 油菜总RNA提取、纯化以及逆转录反应

2.3.5 实时定量RT-PCR分析

2.4 结果

2.4.1 油菜中高盐、干旱胁迫应答基因的筛选和鉴定

2.4.2 13个基因在高盐、干旱胁迫下的表达模式

2.4.3 6个基因在ABA处理下的表达模式

2.4.4 13个基因的组织表达表达模式

2.5 讨论

第三章油菜冷调节基因BnCOR25的功能鉴定

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 菌株和载体

3.1.3 化学试剂及其他材料

3.1.4 工具酶

3.1.5 常用储液以及酵母培养所需储液

3.1.6 常用缓冲液

3.1.7 培养基

3.1.8 Northern杂交所用试剂

3.1.9 PCR分析扩增试剂

3.1.10 DNA测序

3.2 实验方法

3.2.1 拟南芥的培养以及农杆菌介导的遗传转化

3.2.2 拟南芥gDNA的提取

3.2.3 拟南芥总RNA的提取、纯化以及逆转录

3.2.4 Northern杂交

3.2.5 BnCOR25:eGFP载体构建

3.2.6 酵母转化、培养及抗冷性分析

3.2.7 转基因拟南芥抗冷性分析

3.3 结果

3.3.1 BnCOR25基因的分离和鉴定

3.3.2 BnCOR25基因的组织表达

3.3.3 BnCOR25基因的表达受到渗透胁迫和冷的显著诱导

3.3.4 BnCOR25基因的表达依赖于ABA的信号通路

3.3.5 BnCOR25蛋白的亚细胞定位

3.3.6 裂殖酵母（S.pombe）细胞中过量表达BnCOR25基因增强了酵母细胞对冷胁迫的耐受性

3.3.7 BnCOR25过量表达的转基因拟南芥增强了对冷的耐受性

3.4 讨论

第四章油菜BnCIPK6参与非生物胁迫和激素的应答

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 菌株和载体

4.1.3 化学试剂及其他材料

4.1.4 工具酶

4.1.5 常用储液和常用缓冲液

4.1.6 常用培养基

4.2 方法

4.2.1 生物信息学相关网站

4.2.2 油菜无菌苗的培养、各种胁迫处理及材料的收取

4.2.3 油菜和拟南芥RNA提取、纯化及逆转录

4.2.4 实时定量RT-PCR

4.2.5 BnCIPK6:eGFP载体构建

4.2.6 Genome Walker PCR方法调取BnCIPK6启动子

4.2.7 proBnCIPK6/AtCIPK6-GUS融合载体的构建及拟南芥的转化

4.2.8 proBnCIPK6/AtCIPK6-GUS的转基因拟南芥的GUS染色分析

4.2.9 BnCIPK6和BnCIPK6（M）原核表达载体的构建和MBP融合蛋白的表达纯化

4.2.10 BnCIPK6-MBP和BnCIPK6（M）-MBP蛋白的体外磷酸化

4.2.11 BnCIPK6和BnCIPK6（M）过量表达载体的构建及转基因拟南芥的功能鉴定

4.2.12 ABA相关Marker基因的RT-PCR分析

4.2.13 cipk6突变体的鉴定及表型鉴定

4.4 结果

4.4.1 BnCIPK6基因的分离和鉴定

4.4.2 BnCIPK6基因的表达受到高盐胁迫、渗透胁迫、低磷胁迫、ABA和BL的诱导

4.4.3 BnCIPK6基因启动子的分离及其表达模式

4.4.4 BnCIPK6蛋白的亚细胞定位

4.4.5 BnCIPK6蛋白的子磷酸化能力（酶的活性）分析

4.4.6 BnCIPK6和BnCIPK6（M）过量表达转基因拟南芥的功能鉴定

4.4.7 拟南芥CIPK6的表达分析及功能鉴定

4.4.8 在拟南芥Atmkk1 T-DNA插入突变体中分析AtCIPK6的表达

4.5 讨论

第五章 BnCIPK6相互作用蛋白的筛选与鉴定

5.1 引言

5.2 实验材料

5.2.1 植物材料

5.2.2 菌株与质粒

5.2.3 工具酶及试剂盒

5.2.4 化学试剂

5.3 实验方法

5.3.1 酵母双杂交质粒pGBKT7-BnCIPK6和10个拟南芥CBL的pADKT7载体的构建

5.3.2 质粒转化酵母宿主细胞

5.3.3 诱饵蛋白自激活及毒性检测

5.3.4 油菜酵母双杂交cDNA文库构建

5.3.5 酵母结合实验筛选互作蛋白

5.3.6 阳性克隆的鉴定

5.3.7 互作蛋白的分析

5.3.8 BiFC验证分析BnCIPK6和BnCBL1的相互作用

5.4 结果

5.4.1 pGBKT7-BnCIPK6和10个拟南芥CBL的pGADKT7载体的构建

5.4.2 pGBKT7-BnCIPK6融合蛋白的自激活和毒性检测

5.4.3 BnCIPK6与10个拟南芥的CBL的相互作用分析

5.4.4 从油菜酵母双杂交cDNA文库中筛选与BnCIPK6相互作用的蛋白

5.4.5 植物细胞中分析BnCIPK6和BnCBL1蛋白之间的相互作用

5.5 讨论

5.5.1 酵母双杂交技术的应用

5.5.2 BnCIPK6蛋白和拟南芥CBL蛋白之间的相互作用

5.5.3 BnCIPK6蛋白相互作用蛋白的筛选

第六章油菜BnCBL1基因的表达与功能鉴定

6.1 实验材料

6.1.1 植物材料

6.1.2 菌株和载体

6.1.3 化学试剂及其他材料

6.1.4 工具酶

6.1.5 常用储液和常用缓冲液

6.1.6 常用培养基

6.2 方法

6.2.1 油菜无菌苗的培养、材料的收取及各种胁迫处理

6.2.2 油菜和拟南芥RNA提取、纯化及逆转录

6.2.3 实时定量RT-PCR分析BnCBLl基因的表达

6.2.4 BnCBL1:eGFP载体构建

6.2.5 BnCBL1过量表达载体的构建及转基因拟南芥的功能鉴定

6.3 结果

6.3.1 油菜BnCBL1基因的鉴定

6.3.2 油菜BnCBL1基因结构分析

6.3.3 油菜BnCBL1基因的表达模式分析

6.3.4 BnCBL1蛋白的亚细胞定位

6.3.5 BnCBL1过量表达转基因拟南芥在基因组水平和mRNA表达水平的鉴定

6.3.6 BnCBL1过量表达转基因拟南芥增强了对盐胁迫的耐受性

6.3.7 BnCBL1过量表达转基因拟南芥增强了对低磷胁迫的耐受性

6.4 讨论

结论

本论文的主要创新点

参考文献

附录

博士期间撰写和发表的学术论文

致谢

油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究

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