微生物发酵降低卷烟烟气中有害成分及提高卷烟质量的研究

论文摘要

烟草制品是一类特殊的消费品,吸烟者主要是通过吸食烟草燃烧产生的烟气来获得生理和心理上的满足。烟草经高温燃烧释放的烟气中含有大量的有害物质,其中主要的致癌成分包括稠环芳烃、烟草特有氮亚硝胺、气相自由基、一氧化碳等。大量研究证明,这些有害成分主要是由烟草中大分子物质如蛋白质、碳水化合物在高温燃烧过程中转化产生,这些大分子物质不但产生有害成分,而且对卷烟品质有很大的影响。本研究根据烟叶本身化学组成成份的特点,从烟叶和卷烟中分离筛选能够有效降解烟草中的纤维素、蛋白质、果胶、淀粉等大分子物质的微生物,以合适的比例组合施加到烟草中,在微生物及其酶的降解转化作用下,烟草中蛋白质、碳水化合物等能够形成烟气中有害成分的大分子物质被分解转化,形成各类有利于提高烟草品质的小分子物质,从而促进烟草化学成份及物理性能的改变,达到大幅度降低卷烟烟气中的有害成分,改善烟叶的内在品质,提高卷烟品质的目的。从11种不同品牌卷烟中分离得到24株细菌,进行个体形态、菌落形态和16S rDNA的鉴定。结果表明:24株细菌为芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）下的6个种,芽孢杆菌属细菌为优势菌株。6个种分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagllans）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。从已陈化的烟片中分离得到34株细菌。将以上58株细菌进行纤维素酶、蛋白酶、果胶酶和淀粉酶微生物的筛选,经过初筛复筛得到复合酶活高且有较强硝酸盐亚硝酸盐还原能力的细菌3株—QLB6、SHB1和YTB4,其中QLB6纤维素酶活力为309.54U/mL、SHB1蛋白酶活力为532.93 U/mL和YTB4果胶酶活力为341.23 U/mL,同时三株细菌也具有较强其它酶活力。对这3个菌株进行个体形态、菌落形态和16S rDNA的鉴定,结果表明:菌株QLB6、SHB1为芽孢杆菌属（Bacillus）的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,YTB4为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）。为了提高菌株的产酶能力,利用He-Ne激光对菌株QLB6、SHB1和YTB4进行诱变,以期获得更高酶活、传代稳定的正突变株。经过诱变、酶活筛选和硝酸盐亚硝酸盐还原试验,从30株正突变株中得到3株细菌,分别为菌株QLB6F、SHB1D和YTB4A,纤维素酶、蛋白酶、果胶酶酶活与亲本相比分别提高了2.1、1.2和1.4倍。进行10代遗传稳定性试验,试验证明它们具有良好的遗传稳定性。同时微生物相互拮抗试验证明三者之间不存在拮抗作用,可以进行混合发酵。对菌株QLB6F、SHB1D和YTB4A分别进行混合发酵培养基及工艺条件的优化,使用4因素3水平正交试验确定碳源、氮源、pH和培养时间,并在正交试验结果的基础上对起始pH和培养时间进行单因子校正试验,得到的最佳培养基为:1.5%玉米粉作为碳源,1.0%黄豆粉作为氮源,pH 7.0,培养时间24h。通过菌种复配试验,得到最优的菌种组合,比例为2∶1∶2,培养24h后菌数达到13.8×108CFU/mL,发酵液纤维素酶活力、蛋白酶活力、果胶酶活力和淀粉酶活力分别达到1486.71U/mL、797.31U/mL、643.25U/mL、56.55U/mL。以高复合酶活菌株混合培养对烟草进行发酵试验,结果表明:发酵液中的酶以及活菌体能有效在短时间内降低纤维素、蛋白质、果胶及淀粉大分子物质,研究其中的微生物数量变化规律,对酶以及混合培养物的使用进行指导;通过正交试验,确定烟草发酵试验最佳工艺;通过评吸试验,发酵液处理过的烟丝刺激性和杂气明显降低。同时改进发酵工艺,以2.5%的高酶活菌株发酵液添加0.2%的产香酵母（Saccharomyces cerevisiae B181）发酵产物,施加至烟丝中,30℃培养24h,对纤维素、蛋白质、果胶和淀粉的降解率分别为5.6%、1.2%、2.3%和3.1%,香气质和香气量都明显提高,余味十足;10kg烟丝的中试结果表明用混合发酵液处理烟丝,能大幅度全面降低卷烟烟气中自由基、苯并[a]芘等稠环芳烃以及NNK等氮亚硝胺,试验效果显著。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 烟草与人类健康
• 1.1 卷烟烟气
• 1.1.1 稠环芳烃（PAHs）
• 1.1.2 烟草特有氮亚硝胺类物质（TSNA）
• 1.1.3 自由基
• 1.1.4 一氧化碳（CO）
• 1.2 烟草中的化学成分
• 1.2.1 碳水化合物
• 1.2.2 含氮化合物
• 1.2.3 有机酸
• 1.2.4 色素
• 1.2.5 酚类化合物
• 1.2.6 酯
• 1.3 烟气中有害成分的生成
• 1.4 降低卷烟烟气中有害成分的进展
• 2 烟草发酵及微生物的活动
• 2.1 烟草发酵机理
• 2.2 烟草中微生物的分离
• 2.3 烟草发酵中微生物的应用
• 2.3.1 微生物及制剂在烟叶采摘前施加的应用
• 2.3.2 微生物及制剂在烟草复烤前后施加的应用
• 2.3.3 微生物及制剂在烟丝上施加的应用
• 2.4 微生物在烟草发酵中的安全性
• 2.5 微生物降低卷烟烟气有害成分的可行性
• 3 本课题的创新点
• 第二章 卷烟微生物的分离以及高酶活微生物的筛选
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 卷烟取样
• 1.1.2 筛选样品
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 试验器材
• 1.1.5 试验试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 卷烟中细菌、放线菌和真菌的分离
• 1.2.2 烟叶样品中细菌的分离
• 1.2.3 高酶活菌株的分离
• 1.2.4 酶活的测定方法
• 1.2.5 硝酸盐和亚硝酸盐还原能力的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 卷烟样品的微生物分离
• 2.2 高酶活细菌的初筛
• 2.3 高酶活细菌的复筛
• 3 结论
• 4 讨论
• 第三章 卷烟优势微生物及高复合酶活菌株的鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试验仪器
• 1.1.4 试剂与染液
• 1.2 方法
• 1.2.1 个体形态的观察
• 1.2.2 菌落形态的观察
• 1.2.3 生理生化鉴定
• 1.2.4 16S rDNA序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 卷烟分离菌株的鉴定
• 2.1.1 形态鉴定结果
• 2.1.2 生理生化鉴定结果
• 2.1.3 16S rDNA测序结果
• 2.2 酶活筛选细菌的鉴定
• 2.2.1 形态鉴定结果
• 2.2.2 生理生化鉴定结果
• 2.2.3 16S rDNA测序结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 第四章 He-Ne激光诱变育种
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌株的He-Ne激光诱变育种
• 1.2.2 突变菌株的遗传稳定性分析
• 1.2.3 突变菌株的拮抗作用试验
• 2 结果与分析
• 2.1 激光诱变试验结果
• 2.2 正突变菌株的性能考察
• 2.3 突变菌株的遗传稳定性分析
• 2.4 微生物拮抗试验结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 第五章 高酶活菌株混合发酵培养基和工艺的优化
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 仪器
• 1.1.4 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 正交试验
• 1.2.2 单因子校正试验
• 1.2.3 混合发酵菌种比例的优化
• 2 结果
• 2.1 正交试验
• 2.2 单因子的校正
• 2.3 混合发酵菌种比例的确定
• 3 结论
• 4 讨论
• 第六章 微生物施加烟丝发酵试验
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 烟丝
• 1.1.2 微生物混合发酵液
• 1.1.3 菌种
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 主要仪器
• 1.1.6 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 1kg烟丝小试
• 1.2.1.1 降解烟丝成分的研究
• 1.2.1.2 处理工艺的研究
• 1.2.1.3 添加产香酵母的研究
• 1.2.2 烟丝中试
• 1.2.3 测定方法
• 1.2.3.1 烟丝中化学成分的测定
• 1.2.3.2 卷烟烟气中有害成分的测定
• 1.2.3.3 评吸
• 2 结果与分析
• 2.1 烟丝小试接种后活菌数的变化
• 2.2 微生物施加烟丝发酵工艺的优化
• 2.3 烟丝小试评吸结果
• 2.4 添加产香酵母（Saccharomyces cerevisiae B181）的研究
• 2.5 烟草中试
• 3 结论
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 一、发表的学术论文
• 二、参加的学术会议
• 三、获奖情况