一、科斯特罗姆牛杂交改良牦牛的试验研究（论文文献综述）
徐洪涛[1]（2009）在《牦牛Boule基因选择性剪接体及其DNA甲基化修饰分析与犏牛雄性不育的关系》文中研究表明本研究以成年健康雄性牦牛和犏牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆筛选Boule基因的选择性剪接体,对基因序列及其编码的蛋白质结构和功能进行分析,实时荧光定量PCR技术检测Boule基因的选择性剪接体在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平并且运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得牦牛睾丸组织Boule基因差异甲基化区（DMR）序列,运用亚硫酸氢钠测序法检测了该基因基因DMR甲基化状态,为研究犏牛雄性不育与DNA甲基化的关系提供理论基础。1Boule基因选择性剪接体的克隆筛选本试验根据黄牛Boule基因序列（NM001102115）设计两对引物,采用RT-PCR技术着重对Boule基因的开放阅读框进行扩增,结果第一对引物扩增出两条序列长分别为802bp和766bp,第二对引物扩增出的序列长362bp,序列拼接后为两条序列：1037bp、1001bp,GenBank登录号分别为：GU187434; GU187435。对这两条序列进行分析,我们找到了标准的"GT"、"AG"位点,严格遵循"GT-AG"剪接规则。因此我们可以断定这两条序列为Boule基因的两条选择性剪接体,分别命名为Boulel、 Boule2。2Boulel、Boule2核苷酸及蛋白序列的生物信息学分析分析借助生物信息学网络资源和相关生物学软件,筛选出的Boulel（?）勺开放阅读框长849bp,跟正常序列相比缺失了外显子3的5’端36bp碱基,从而导致开放阅读框少了12个氨基酸残基,氨基酸比对发现剪接部位位于RRM结构域内,但是没有影响到RNP1、RNP2区域,Boule基因的Reapt区域未发生剪接；Boule2的开放阅读框长813bp,跟正常序列相比缺失了外显子3的5’端72个bp碱基,从而导致开放阅读框少了24个氨基酸残基,氨基酸比对发现在RRM区域没有发生剪接,选择性剪接发上在Boule基因的Reapt区域。对两者的蛋白分析发现,Boulel比Boule2少一个α螺旋,它们的RRM三维结构也证实了这一点,推测Boulel与雄性不育有着密切的关系。3牦牛和犏牛睾丸组织中Boulel、Boule2的mRNA表达水平利用Real-time PCR技术对牦牛和犏牛睾丸组织中Boulel、Boule2的mRNA的表达进行定量分析,结果表明牦牛睾丸组织中剪接体Boulel的mRNA表达量高而犏牛的表达量低,其中犏牛与牦牛的表达量差异极显着（P<0.01）。牦牛睾丸组织中剪接体Boule2的mRNA表达量高而犏牛的表达量低,其中犏牛与牦牛的表达量差异不显着（P>0.05）。4牦牛Boule基因5’端CpG岛的分子克隆及序列分析本实验根据黄牛Boule基因序列（NW001494657.1）设计引物扩增了牦牛Boule基因的5’端序列,并对牦牛、黄牛和犏牛Boule基因的甲基化水平进行了分析,结果发现：牦牛Boule基因的5’端存在CpG岛,CpG岛长2000bp,包含启动子区、第一外显子和第一内含子；犏牛Boule5’端DNA甲基化水平（17.5%）极显着高于黄牛（5.2%）和牦牛（7.0%）（P<0.01）。可见犏牛Boule基因的高甲基化与其mRNA表达缺乏、雄性不育的表型是一致的,说明Boule基因的甲基化对Boule基因mRNA的表达调控起重要作用,可能对犏牛生精细胞减数分裂、雄性不育有重要影响。
李新福[2]（2009）在《DAZ基因家族DAZL/BOULE与犏牛雄性不育关系的研究》文中研究指明牦牛是牛属动物中唯一能适应高寒气候环境而延续至今的牛种,属珍稀畜种资源和生产性能低的原始牛种,也是世界屋脊的“景观牛种”。为了提高其生产性能,人们一直利用普通牛同牦牛进行种间杂交,获得具有明显杂种优势的一代杂种犏牛。但由于犏牛雄性不育,种间杂交不能达到改良牦牛遗传本质和充分利用牦牛遗传资源的目的,杂种优势的利用和新型牛种的培育均受到了极大的限制,成为牦牛杂交改良的“拦路虎”。近几十年来,为探讨犏牛雄性不育的问题,国内外许多学者对犏牛雄性不育这一复杂的生物现象坐了很多有意义的研究和探讨,但至今尚未找到犏牛雄性不育的主导原因。DAZ基因家族包括DAZ（Deleted in Azoospermia）、DAZL（DAZ-like）和BOULE基因,是精子生成的重要调控因子。DAZL起源于BOULE基因,位于人类2号染色体,BOULE位于人类的3号染色体上,是DAZ基因家族的祖先基因。为了探讨犏牛雄性不育问题,本研究以成年健康雄性黄牛、牦牛和犏牛为研究对象,运用组织切片、RT-PCR克隆测序、Real-time PCR技术、原位杂交技术以及二级结构预测和系统发育分析对DAZL和BOULE基因的组织表达、在睾丸组织中的表达差异水平分析,和BOULE基因在黄牛精子发生中的组织定位,为研究犏牛雄性不育与DAZ基因家族的关系提供理论基础。1.牦牛、犏牛DAZL基因的克隆、序列分析及表达的研究本试验根据黄牛DAZL基因序列EF501823设计引物扩增出牦牛和犏牛全长分别为1772bp、1778bp的序列,两段序列包含完整的ORF编码区,全长为885bp,编码295个氨基酸。生物信息学研究发现,黄牛编码区序列与牦牛和犏牛分别为同源性分别为99.43%、98.31%,与其他动物也具有较高的同源性。含有DAZ家族所具有的典型的RRM结构域、DAZ重复基序,同时在N端还具有高度保守的PABP作用位点和Pumilio-2作用位点,说明脊椎动物的DAZL基因在进化上是高度保守的。系统发育树分析,聚类结果与经典分类学结果基本一致,实时荧光定量PCR显示,DAZL在三种牛睾丸组织中的表达量中,黄牛与牦牛差异显着（P<0.05）,黄牛与犏牛,犏牛与牦牛差异不显着（P>0.05）.推测DAZL基因与犏牛雄性不育无关.2.牦牛、犏牛BOULE基因的克隆、序列分析及表达的研究本试验根据黄牛BOULE基因序列（NM001102115）设计引物扩增出牦牛和犏牛的全长分别为1647bp、1650bp,该序列包含完整的编码区,二者也都含有885bp的相同的完整开放阅读框（ORF）,编码一个295个氨基酸蛋白,进行同源性比对,结果发现牦牛、犏牛和黄牛BOULE基因编码区核苷酸序列的同源性为99.85%,氨基酸序列的同源性为98.31%,在编码区内,三个物种共发现了4处碱基差异（0.45／100bp）,与其他动物也具有较高的同源性,也含有DAZ基因家族所具有的典型的RRM结构域、DAZ重复基序。系统发育分析与经典分类结果也基本一致。实时荧光定量PCR显示,BOULE基因在三种牛睾丸组织中的表达量中,黄牛与牦牛差异不显着（P>0.05）,黄牛、牦牛,与犏牛差异显着（P<0.05）。推测BOULE基因与犏牛雄性不育有一定的关系。3.黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织学观察和BOULE m RNA在睾丸组织的表达研究制作黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织的的石蜡切片并HE染色发现,黄牛睾丸组织生精小管发育正常,可见各级生精细胞,内有不同时期大量的生精细胞,间质组织和生精小管无间隙小或间隙小,而牦牛睾丸组织生精小管也发育正常,可见各级生精细胞,犏牛睾丸组织生精小管官腔大小及形态不一致,管壁皱缩,生精小管上皮多由1～2层精原细胞构成,有些精原细胞已经死亡,初级精母细胞很少,无次级精母细胞犏牛生精小管由1～2层精原细胞构成,精母细胞少,间质组织与基底膜间隙宽,由组织液填充。原位杂交结果显示,BOULE基因主要分布在初级精母细胞和次级精母细胞中,在其余各级细胞中未发现其表达,推测犏牛精子发生失败,生精细胞凋亡等表象可能与BOULE基因的表达有一定的关系。
赵炳尧,陈慧如[3]（1985）在《科斯特罗姆牛杂交改良牦牛的试验研究》文中提出 国营河曲种畜场于一九六一年五月,自甘肃省畜牧厅岔口驿家畜良种培育辅导站引进科斯特罗姆种公牛一头,进行了采用常温精液人工授精方法杂交改良牦牛的试验研究。参试牛群选个体较大的7—10岁经产牦母牛群,试验工作开始前,全部隔离牦公牛,并将参试牛调至优质草场单独放牧、抓膘,为开展人工授精工作做好准备。试情公牛为阿司玛(藏语音,意为新去
乌市104团场[4]（1982）在《肉牛与牦牛种间杂交效果的试验报告》文中指出 乌鲁木齐市104团是新疆农垦系统饲养牦牛比较集中的单位,现有牦牛5027头,其中母牦牛1350头。由于长期自然选择大于人工选择,以及恶劣的自然气候环境和放牧管理粗放,形成了这个地区的牦牛晚熟、体小、周转慢、产品率低等不利性状。远在1964年104团前身生产兵团农六师天山九场曾引进了科斯特罗姆种公牛行常温输精,试图改良牦牛,但由于种公牛不适应高寒山区的自然条件,加之饲养费用高、操作复杂等原因于1966年中断,三年共获犏牛30余头。由于现代遗传科学的迅速发展,在国内外的养牛业中,利用"杂种优势"生产不同
二、科斯特罗姆牛杂交改良牦牛的试验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、科斯特罗姆牛杂交改良牦牛的试验研究（论文提纲范文）
（1）牦牛Boule基因选择性剪接体及其DNA甲基化修饰分析与犏牛雄性不育的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 牦牛及犏牛雄性不育的研究概况 |
| 1 我国牦牛资源及其遗传改良 |
| 1.1 牦牛资源概况 |
| 1.2 牦牛的遗传改良 |
| 2 犏牛雄性不育的研究 |
| 2.1 细胞遗传学的研究 |
| 2.2 组织形态学的研究 |
| 2.3 生化遗传学研究 |
| 2.4 生殖内分泌学的研究 |
| 2.5 BOULE基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 选择性剪接体的研究进展 |
| 1 选择性剪接的机制 |
| 1.1 RNA的剪接 |
| 1.2 RNA的选择性剪接 |
| 2 选择性剪接的调节机制 |
| 2.1 mRNA剪接位点的选择 |
| 2.2 调控选择性剪接的途径 |
| 2.2.1 信号传导途径调节选择性剪接 |
| 2.2.2 PTB/hnRNP调节选择性剪接 |
| 2.2.3 GC-AG型内含子的剪接 |
| 2.2.4 多因素调节选择性剪接 |
| 2.2.5 mRNA选择性剪接与疾病 |
| 参考文献 |
| 第三章 DNA甲基化及其检测方法研究进展 |
| 1 DNA甲基化与CPG岛 |
| 2 DNA甲基化检测的目的和意义 |
| 3 DNA甲基化的研究方法 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第四章 牦牛睾丸组织中BOULE基因选择性剪接体的筛选、鉴定及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 仪器 |
| 1.3 组织总RNA提取和反转录 |
| 1.3.1 组织总RNA提取 |
| 1.3.2 反转录过程 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 RT-PCR反应和产物回收 |
| 1.5.1 RT-PCR反应 |
| 1.5.2 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 1.5.3 目的片段回收 |
| 1.6 将目的片段连接到pMD19-T Vector上(TA克隆) |
| 1.6.1 PCR产物与pMD19-T Vector连接反应 |
| 1.6.2 DH5α感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 1.6.3 转化 |
| 1.6.4 质粒DNA的提取(碱裂解法) |
| 1.7 序列的拼接与生物信息学分析 |
| 1.8 荧光实时定量PCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牦牛睾丸组织Boule基因选择性剪接体的筛选结果 |
| 2.2 Boule基因剪接变异体序列分析 |
| 2.3 Boule基因选择性剪接产物编码蛋白的结构特征分析 |
| 2.4 Boule基因选择性剪接体蛋白的二级结构和三维结构预测 |
| 2.5 牦牛、犏牛睾丸组织Boule1、Boule2剪接体mRNA荧光定量分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 牦牛BOULE基因5’端CPG岛DNA甲基化水平及其与犏牛雄性不育的关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 牦牛睾丸组织基因组DNA的提取 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 Boule基因5’端差异甲基化区域的扩增 |
| 1.6 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 1.7 目的片段回收 |
| 1.8 将目的片段连接到pMD19-T Vector上(TA克隆) |
| 1.8.1 PCR产物与pMD19-T Vector连接反应 |
| 1.8.2 DH5α感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 1.8.3 转化 |
| 1.8.4 质粒DNA的提取(碱裂解法) |
| 1.9 序列的拼接与生物信息学分析 |
| 1.10 基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰 |
| 1.11 BSP扩增反应 |
| 1.12 序列的确认与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 克隆与测序 |
| 2.2 同源性分析 |
| 2.3 序列特征分析 |
| 2.4 牦牛Boule基因5'端DMR的BSP扩增 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 全文创新 |
| 附录 |
| 1 RNA提取所需DEPC水的配制 |
| 2 聚丙烯酰胺电泳及银染配方 |
| 2.1 PAGE电泳 |
| 2.2 银染 |
| 3 琼脂糖电泳试剂配制 |
| 4 牦牛睾丸BOULE1蛋白的ELM分析 |
| 致谢 |
（2）DAZ基因家族DAZL/BOULE与犏牛雄性不育关系的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 牦牛的改良途径及杂种一代犏牛雄性不育研究进展 |
| 1 牦牛遗产改良的三个方向 |
| 1.1 本品种的选育 |
| 1.2 引入野牦牛外血 |
| 1.3 种间杂交 |
| 2 犏牛雄性不育的研究 |
| 2.1 细胞遗传学的研究 |
| 2.2 生化遗传学研究 |
| 2.3 组织形态学生殖内分泌学 |
| 2.4 促进育性恢复研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 精子的发生及调控精子发生的相关基因 |
| 1 精子发生的基因调控 |
| 1.1 精子细胞中CREM基因的表达调控 |
| 1.2 SCF/C-KIT系统 |
| 1.3 热休克蛋白家族(heat shock protein,HSP) |
| 1.4 DAZ基因家族 |
| 1.5 Bcl-2家族 |
| 1.6 其他基因 |
| 2 研究与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 DAZ基因家族研究进展和原位杂交技术原理 |
| 1 DAZ基因家族研究现状 |
| 1.1 DAZ基因家族的发现和研究进展 |
| 1.2 基因家族的结构和进化分析 |
| 2 原位杂交组织化学技术的原理 |
| 3 原位杂交探针的种类 |
| 3.1 按探针的核酸性质分类 |
| 3.2 按探针的标记物分类 |
| 3.3 按探针的来源分类 |
| 3.4 原位杂交探针的标记法 |
| 3.5 原位杂交的关键技术 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第四章:牦牛、犏牛DAZL基因的克隆和序列分析及表达的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 组织总RNA提取和反转录 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 RT-PCR反应和产物回收及克隆测序 |
| 1.6 荧光实时定量PCR |
| 1.7 系统发育树的构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牦牛、犏牛DAZL基因RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 牦牛、犏牛DAZL基因编码区的序列分析 |
| 2.3 黄牛、牦牛、犏牛DAZL基因二级结构的预测 |
| 2.4 系统发育分析 |
| 2.5 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织DAZL基因mRNA表达水平分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章:牦牛、犏牛BOULE基因的克隆和序列分析及表达的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 组织总RNA提取和反转录 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 PCR反应和产物回收及克隆测序 |
| 1.6 荧光实时定量PCR |
| 1.7 系统发育树的构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牦牛、犏牛BOULE基因RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 牦牛、犏牛BOULE基因编码区的序列分析 |
| 2.3 牦牛、犏牛BOULE基因二级结构的预测 |
| 2.4 系统发育分析 |
| 2.5 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织BOULE基因mRNA表达水平分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章:原位杂交检测BOULE在黄牛睾丸组织中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 探针的设计和制备 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 石蜡组织切片的制备 |
| 1.6 杂交过程 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黄牛和犏牛睾丸组织切片观察结果 |
| 2.2 黄牛睾丸组织原位杂交观察结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 全文创新 |
| 附录 |
| 1 组织切片试剂配制 |
| 1.1 磷酸缓冲盐溶液(PBS) |
| 1.2 10%中性甲醛固定液 |
| 1.3 生理盐水 |
| 2 RNA提取所需DEPC水的配制 |
| 3 聚丙烯酰胺电泳及银染配方 |
| 3.1 PAGE电泳 |
| 3.2 银染 |
| 4 琼脂糖电泳试剂配制 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、科斯特罗姆牛杂交改良牦牛的试验研究（论文参考文献）
- [1]牦牛Boule基因选择性剪接体及其DNA甲基化修饰分析与犏牛雄性不育的关系[D]. 徐洪涛. 南京农业大学, 2009(06)
- [2]DAZ基因家族DAZL/BOULE与犏牛雄性不育关系的研究[D]. 李新福. 南京农业大学, 2009(S1)
- [3]科斯特罗姆牛杂交改良牦牛的试验研究[J]. 赵炳尧,陈慧如. 中国牦牛, 1985(01)
- [4]肉牛与牦牛种间杂交效果的试验报告[J]. 乌市104团场. 中国牦牛, 1982(01)