乳酸菌和大肠杆菌对固定化犬肠道粘蛋白模型的粘附性研究

论文摘要

本研究采用双层琼脂法测定了两株犬源乳酸菌E01和E16对两株致病性大肠杆菌ATCC25922和CVCC2060的抑菌效果,其抑菌圈的大小范围为13mm-16mm左右。其中乳酸菌E01对大肠杆菌CVCC25922抑菌效果最好,抑菌圈直径为16.67mm。结合生化试验和细菌16S rDNA片段序列结果,鉴定犬源乳酸菌E01为耐久肠球菌（相似率97%）,E16为乳酸肠球菌（相似率99%）。采用固定粘蛋白模型,结合同位素γ-32P-ATP标记细菌法,检测犬源耐久肠球菌E01和乳酸肠球菌E16、犬源大肠杆菌DE、鸡源德氏乳酸杆菌德氏亚种N11及猪源约氏乳杆菌JJB3和致病性大肠杆菌ATCC25922和CVCC2060对中华田园犬幼犬各肠段粘液蛋白的粘附能力,结果所有测试菌株均能不同程度地粘附犬十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠粘蛋白,而且对不同肠段粘蛋白模型的粘附率不相同。其中耐久肠球菌E01粘附率最高,达15.60—25.71%;大肠杆菌CVCC 2060粘附率最低,为2.88—5.74%。两株致病性大肠杆菌ATCC25922和CVCC 2060在各肠段的粘附率都低于四株乳酸菌E01、E16、JJB3和N11。以高碘酸钠和胰蛋白酶分别修饰犬源乳酸肠球菌E16和犬源大肠杆菌DE,探究其各自粘附机制;另外以两种处理方式分别修饰粘蛋白后进行粘附实验,探究其各自粘附受体。两种处理方式均使乳酸肠球菌E16的粘附比率显著降低（P＜0.05）,大肠杆菌DE经胰蛋白酶处理后,粘附率也降低,但经高碘酸钠处理后粘附率无明显变化。说明乳酸肠球菌E16表面的碳水化合物结构和糖蛋白参与了粘附过程,大肠杆菌菌体蛋白在粘附过程中发挥一定作用。粘蛋白经胰蛋白酶修饰后,对乳酸肠球菌E16和大肠杆菌DE的粘附性均无影响,经高碘酸钠处理后对乳酸肠球菌E16粘附性无影响,但大肠杆菌DE的粘附率显著降低（P＜0.05）。结果说明乳酸肠球菌的粘附受体对这两种试剂处理不敏感,大肠杆菌DE的粘附受体具有碳水化合物结构,可能为糖蛋白类物质。最后分别采用排斥、竞争和取代三种作用方式研究两株犬源肠球菌对两株致病性大肠杆菌粘附的抑制作用。结果表明三种作用方式均能不同程度的抑制大肠杆菌的粘附作用,取代和排斥两种方式能显著降低大肠杆菌的粘附率（P＜0.05）,但是,两株肠球菌的抑制效果存在较大差异。试验结果表明两株犬源乳酸菌具有开发为预防和治疗犬消化道疾病的益生菌潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 犬用微生态制剂的研究
• 1.1.1 肠球菌和乳酸杆菌制剂
• 1.1.2 芽孢杆菌制剂
• 1.2 粘液组成及粘蛋白特性
• 1.3 粘液的作用
• 1.4 细菌粘附的生理特性
• 1.5 细菌粘附的机制研究
• 1.5.1 乳酸菌类粘附机制
• 1.5.1.1 脂磷壁酸
• 1.5.1.2 表面层蛋白
• 1.5.1.3 乳酸菌粘附受体
• 1.5.2 大肠杆菌类粘附机制
• 1.6 乳酸菌对固定化粘蛋白模型粘附研究
• 1.7 乳酸菌对致病菌的粘附抑制作用
• 1.8 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 菌种和培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 OD值与活菌数关系的测定
• 2.2.1.1 活化菌株
• 2.2.1.2 分时段接种
• 2.2.1.3 数据统计
• 2.2.2 犬源乳酸菌与致病性大肠杆菌体外拮抗实验
• 2.2.2.1 活化菌株
• 2.2.2.2 滴种法接种
• 2.2.2.3 软琼脂致病性大肠杆菌菌液配制
• 2.2.2.4 抑菌试验
• 2.2.3 犬源乳酸菌菌株鉴定
• 2.2.3.1 乳酸菌DNA提取
• 2.2.3.2 PCR反应体系和条件
• 2.2.3.3 点样和电泳
• 2.2.3.4 DNA测序与比对
• 32P-ATP标记对细菌生长影响实验'>2.2.4 r-³²P-ATP标记对细菌生长影响实验
• 2.2.4.1 标记与未标记细菌培养
• 2.2.4.2 标记与未标记菌液活菌计数
• 2.2.5 粘附性实验
• 2.2.5.1 细菌的培养及标记
• 2.2.5.2 粘液的制备
• 2.2.5.3 细菌粘附实验
• 2.2.5.4 细菌经修饰后粘附实验
• 2.2.5.5 粘液经修饰后粘附实验
• 2.2.6 乳酸菌对病原菌排斥作用
• 2.2.7 乳酸菌与病原菌竞争作用
• 2.2.8 乳酸菌对病原菌取代作用
• 2.2.9 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 OD值与活菌数关系
• 3.1.1 大肠杆菌OD值与活菌数关系
• 3.1.2 乳酸菌OD值与活菌数关系
• 3.2 犬源乳酸菌与致病性大肠杆菌体外拮抗结果
• 3.3 犬源乳酸菌种属鉴定结
• 3.4 放射性标记与未标记细菌生长结果
• 3.5 各细菌在犬肠粘液上粘附结果
• 3.6 细菌经修饰后和粘蛋白经修饰后粘附结果
• 3.7 乳酸菌对病原菌排斥作用结果
• 3.7.1 排斥作用
• 3.7.2 竞争作用
• 3.7.3 取代作用
• 4 讨论
• 4.1 细菌OD值与活菌数关系
• 4.2 乳酸菌对大肠杆菌体外拮抗作用
• 4.3 两株肠球菌的背景及应用
• 4.4 细菌体外粘附性方法比较
• 4.5 粘附生理特性与不同肠段粘附性
• 4.6 细菌的粘附机制
• 4.7 肠球菌与病原菌相互作用
• 4.7.1 取代作用
• 4.7.2 排斥作用
• 4.7.3 竞争作用
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢