论文摘要
肝脏是人体重要的代谢器官，与人类许多遗传性疾病、代谢性疾病、肿瘤密切相关。同时，肝脏是一个重要的蛋白质合成场所，其作为生物反应的靶器官能分泌大量蛋白质入血，改变生物行为与特征。这些均使肝脏成为重要的基因治疗的靶向器官。然而，目前大多数的病毒和非病毒基因载体都缺乏细胞靶向性，从而限制了基因治疗的体内应用。受体介导基因转移是近年来发展起来的一种利用细胞表面受体对特异配体的识别和内吞作用，将与配体结合的外源基因转移到细胞内进行表达的基因转移重要策略。去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）是哺乳动物肝实质细胞特有的一种数量丰富，高效的内吞受体。ASGPR能专一性识别、结合并内吞血液循环中末端带有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白，利用这个特性可以将一些用于基因传递的阳离子脂质体经过半乳糖修饰以后，定向的转入到肝脏细胞中发挥作用。为了构建一种稳定性好、具有靶向传输作用的基因载体，本文利用主要存在于肝脏细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）对半乳糖基的特异性识别作用，以胆固醇为母体，设计合成了一系列胆固醇的半乳糖苷衍生物，制备带有不同半乳糖苷的脂质体；然后与鱼精蛋白—DNA缩合物作用形成半乳糖苷修饰的脂质体-鱼精蛋白-DNA复合物（Galactosylated liposome-protamine-DNA complexes，Gal-LPD）。我们首先利用转化的大肠杆菌大量扩增了实验需要的报告基因LacZ质粒DNA，利用阴离子交换树脂分离纯化了质粒，采用紫外分光光度法测定了其含量，通过计算A260／A280的比值，证明其纯度符合要求：我们又采用琼脂糖凝胶电泳进一步考察了质粒DNA的纯度和构型，结果表明纯化产物的纯度和构型均符合要求。我们以胆固醇为母体，以不同长度的聚乙二醇作为连接胆固醇和半乳糖苷的功能桥试剂，分别连接了单半乳糖苷，季戊四醇为核心的三半乳糖苷和肌醇为核心的五半乳糖苷，共合成了18种不同链长和带有不同数量半乳糖苷的胆甾半乳糖苷衍生物。我们采用荧光分光光度法，利用荧光染料Hoechst 33258与DNA结合发出荧光的原理，建立了DNA的含量测定方法。我们用薄膜-超声法，制备了空白脂质体，并通过正交设计确定了脂质体的处方；随后用合成的一系列不同链长和带有不同数量半乳糖基的胆甾半乳糖苷制备空白脂质体，然后与适量的鱼精蛋白-DNA复合物在室温孵育后，得到18种半乳糖修饰的LPD（Gal-LPD）和用未修饰的胆固醇制备的空白脂质体与鱼精蛋白—DNA缩合物孵育形成的LPD0为对照LPD；通过测定LPDs的电位和粒径，Gal-LPD的Zeta电位和粒径随着半乳糖基数量和链长的不同而变化。Gal-LPD在透射电镜下观察为规则的圆球；包封率均在85％以上，并且可以保护DNA不被核酸酶降解。我们运用体外细胞培养技术，以pORF-LacZ为报告基因，考察了LPDs的体外细胞转染能力。我们用LPDs分别转染了肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549，结果发现在HepG2细胞中，单半乳糖苷修饰的LPDⅡb，三半乳糖苷修饰的LPDⅢc和五半乳糖苷修饰的LPDⅣe的转染效率分别比LPD0提高了1．6倍、1．8倍和2．1倍。而半乳糖化的LPDs在A549细胞中的转染率与LPD0相比都有所下降，且随着半乳糖基数量的增多转染效率下降的也越多。而且半乳糖可以竞争抑制Gal—LPD在HepG2细胞中的转染效率。进一步实验表明DDAB与DNA的比例可以影响转染效率，且转染具有一定的剂量依赖性。MTT实验分析表明Gal-LPDs对HepG2和L929细胞均无明显细胞毒性。本文研究结果表明，半乳糖苷修饰的LPD可以被肝细胞表面的ASGPR所识别，而且对ASGPR的亲和力随着半乳糖基数量的增加而增强，转染效率也随之提高。Gal-LPD在基因给药系统中的应用，尤其是体内应用，值得我们进一步探讨和深入。
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标签：基因治疗论文; 非病毒载体论文; 靶向传递论文; 脂质体鱼精蛋白复合物论文; 半乳糖苷论文;