论文摘要
目的NK细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。其杀伤功能的出现不需要预先刺激或致敏,无MHC（组织相容性复合物）限制性。NK细胞不仅能够介导对肿瘤细胞的天然杀伤作用,还能够调节特异性和非特异性免疫应答。过继转输活化的或同种异体的NK细胞,已经应用于白血病和某些实体肿瘤的治疗中。白细胞介素-15（IL-15）由多种组织和细胞亚群产生,与IL-2在功能上有许多相似之处,可以诱导CD34+的细胞分化为NK细胞,并且能够促进NK细胞的增殖,增强NK细胞的杀伤活性。我们已经建立了IL-15基因修饰的NK-92细胞系,证实IL-15的基因修饰能够增强NK-92细胞对多种肿瘤的杀伤能力。与NK-92细胞相比,NKL细胞有着不同的杀伤谱,比如,NKL对于人胃癌细胞系SGC7901的杀伤能力强于NK-92细胞,因此可以作为NK-92的重要补充。NKL细胞系由Robertson等建立,来源于CD3-CD16+CD56+的大颗粒淋巴细胞白血病患者的外周血。NKL依赖于IL-2生长,具自然杀伤活性和ADCC效应,其增殖反应也与正常的CD16+CD56dim NK细胞相似。NKL是NK细胞系中与原始NK细胞最为相近的,因此成为过继免疫治疗的又一重要选择。本文建立了稳定转染hIL-15的NKL细胞系,证明IL-15基因修饰的NKL细胞具有更强的增殖、抗凋亡和对肝癌细胞的杀伤作用,并初步探讨了其分子机制。方法1.电转将IL-15基因稳定转染入NKL细胞系。2.CTLL-2增殖分析测定细胞培养上清中IL-15的生物学活性。3.酶联免疫吸附分析测定细胞培养上清中IL-15的浓度。4.RT-PCR检测三种NKL细胞中凋亡相关基因和杀伤相关基因的表达水平。5.CCK方法用于分析三种NKL细胞在不同浓度IL-2和IL-15条件下的增殖水平。6.流式细胞术检测三种NKL细胞凋亡、周期以及膜表面NKG2D和NKG2A分子的表达。7.MTT方法检测三种NKL细胞的细胞毒作用。结果1.建立了稳定表达人IL-15的基因修饰NKL-IL15细胞系。2.IL-15基因修饰的NKL细胞在低剂量IL-2和IL-15条件下具有更强的增殖活性。3.IL-15基因提高NKL细胞系的抗凋亡作用。4.IL-15的基因上调NKL细胞系中抗凋亡基因的表达。5.IL-15基因对NKL细胞系的细胞周期没有明显影响。6.IL-15基因修饰的NKL细胞在体外对肝癌细胞具有更强的杀伤活性。7.IL-15基因上调NKL细胞杀伤相关分子的表达。8.IL-15基因修饰的NKL细胞在体内能够有效抑制肝癌细胞的增殖。结论NK细胞作为固有免疫的重要组成部分,是抵御病毒感染和肿瘤细胞的第一道防线,由于无需抗原预先作用,就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞,因此,在肿瘤免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。应用NK细胞系成为肿瘤生物治疗的重要手段,其中NK-92细胞已经进入期临床试验。为了克服NK细胞系在应用中的某些不足,基因修饰已经成为增强NK细胞杀伤活性的主要手段。迄今为止,已有IL-2,IL-15,SCF,CD20等多种基因用于修饰NK-92细胞,取得重要进展。为了获得临床应用的NK细胞株,我们成功建立了IL-15基因修饰的NKL细胞株,IL-15基因修饰的NKL细胞株在低剂量IL-2和IL-15条件下表现出更强的增殖能力,并且在无血清饥饿状态下表现出较强的抗凋亡作用。进一步研究表明,在IL-15基因修饰的NKL细胞中,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1表达水平显著升高,凋亡基因Bim、Noxa、Fas的表达水平则降低。更为重要的是NKL-IL-15细胞不仅在体外能够有效杀伤肝癌细胞HepG2、H7402、PLC/PRF-5,亦能显著增强体内对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用。这种抗肿瘤效应与NKL-IL15细胞IFN-γ、FasL和Perforin基因的表达水平提高相关。因此,人IL-15基因修饰的NKL细胞的生物学特征更有利于临床过继免疫治疗的应用。
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