猪Myostatin基因RNA干扰及启动子研究

论文摘要

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）,是TGF-β（transforming growing factor-β）超家族成员,是肌肉细胞的自分泌因子,主要在动物骨骼肌中特异性表达并对肌肉的生长发育起到负调控作用。该基因敲除的小鼠,其骨骼肌重量增加到正常小鼠的两倍左右。RNA干扰（RNAi）是一种特异性降解靶基因mRNA序列的基因表达调节机制,具有高效、特异、快速等优点,已成为研究基因功能和表达调控的有效方法。因此,本实验利用PCR方法以猪骨骼肌cDNA为模板克隆Myostatin基因并构建真核表达载体pMSTN-1;针对猪肌生成抑制素基因mRNA3个干涉位点,设计合成三对特异的shRNA干扰序列和一对非特异的shRNA干扰序列,通过退火形成双链后依次将其连入带有U6启动子的干涉载体pGenesil-1上,构建干扰载体。得到含四个目的DNA片段的重组质粒分别脂质体转染过表达Myostatin细胞,利用real time-PCR检测各实验组细胞中Myostatin在mRNA水平的表达,检测干扰效果。结果表明3个干扰片段均在一定程度上下调了MSTN mRNA的表达。shRNA1、shRNA 2和shRNA 3对MSTN基因的抑制率分别为69.82%、80.97%和87.52%,同时转染shRNA0也能抑制MSTN基因的表达但是差异不显著,3对干扰序列间干扰水平无明显差异。同时本研究中,对Myostatin基因启动子功能进行了研究。利用PCR方法从猪基因组DNA中分离了1.2 kb的Myostatin基因启动子（Pro）序列。该启动子序列与已报道的GenBank序列:AJ133580和AY527153相应序列的相似度分别为100%和99.5%,进一步以GFP为报告基因,构建真核表达载体MSTNPro-EGFP;通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系和猪成纤维细胞,对猪Myostatin基因启动子的转录调控活性进行鉴定。结果表明,本实验成功克隆了猪Myostatin基因启动子,并且构建了真核表达载体,猪Myostatin基因启动子可以启动GFP在C2C12细胞中的转录和表达,而将猪MSTNProEGFP载体转染猪胎儿成纤维细胞后并未观察到GFP的表达,说明Myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 肌肉生长抑制素（Myostatin）
• 1.1.1 肌肉生长抑制素基因的发现
• 1.1.2 Myostatin 基因的结构
• 1.1.3 Myostatin 基因表达特异性
• 1.1.4 Myostatin 基因生物学功能
• 1.1.5 Myostatin 基因的应用前景
• 1.1.6 Myostatin 基因的启动子
• 1.2 RNA 干扰
• 1.2.1 RNA 干扰现象的发现
• 1.2.2 RNA 干扰的机制
• 1.2.3 哺乳动物的 RNA 干扰
• 1.3 RNAI 在MSTN 基因功能研究中的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒和细胞
• 2.1.2 工具酶、试剂盒及其它试剂
• 2.1.3 主要器材
• 2.1.4 缓冲液及主要试剂的配制
• 2.1.5 主要生物学分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 猪胎儿成纤维细胞的分离培养
• 2.2.2 基因组DNA 及总cDNA 的获得
• 2.2.3 猪Myostatin 基因克隆及真核表达载体的构建
• 2.2.4 构建过表达MSTN 的成纤维细胞系
• 2.2.5 shRNA 真核表达载体的构建
• 2.2.6 干扰效率的测定
• 2.2.7 MSTN 启动子的验证
• 3 结果与分析
• 3.1 MSTN 克隆质粒的构建及鉴定
• 3.1.1 PCR 扩增MSTN 目的片段
• 3.1.2 pMD-MSTN 重组质粒的酶切鉴定
• 3.1.3 克隆质粒pMD-MSTN 的序列分析
• 3.1.4 pMSTN-1 真核表达质粒的鉴定
• 3.2 过表达MSTN 成纤维细胞的建系与鉴定
• 3.2.1 表达MSTN 成纤维细胞DNA 水平的检测
• 3.2.2 表达MSTN 成纤维细胞mRNA 水平的检测
• 3.3 SIRNA 真核表达载体的构建
• 3.3.1 siRNA 退火合成shRNA
• 3.3.2 pGenesil-1 质粒载体线性化
• 3.3.3 干扰载体pGe-MSTNshRNA 的构建及鉴定
• 3.4 干扰效率的测定
• 3.5 MSTN 启动子功能的验证
• 3.5.1 PCR 扩增MSTNPro 目的片段
• 3.5.2 pMD-MSTNPro 重组质粒的酶切鉴定
• 3.5.3 克隆质粒pMD-MSTNPro 的序列分析
• 3.5.4 MSTNPro-EGFP 真核表达质粒的鉴定
• 3.5.5 猪Myostatin 基因启动子在C2C12 细胞和成纤维细胞中的转录调控活性
• 4 讨论
• 4.1 Myostatin 基因编码区的克隆
• 4.2 过表达Myostatin 基因成纤维细胞的建立
• 4.3 Myostatin 基因的RNA 干扰
• 4.4 Myostatin 启动子研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文