昆虫抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达

论文摘要

抗菌肽（Antimicrobial Peptides，APs）是昆虫免疫系统的重要组成部分。目前发现的昆虫抗菌肽除了具有抗细菌的活性以外，还具有抗真菌、病毒、原虫和癌细胞等作用。并且其抗菌机理不同于传统的抗生素药物，不容易产生耐药性。所以在新药开发等方面具有很大的优势和潜力。但目前天然抗菌肽在活性等方面还存在不足，还不能满足工业生产的需要。因此本文的研究目的是尝试在果蝇类为主的天然昆虫抗菌肽的基础上，设计合成一段抗菌肽，并利用毕赤酵母表达系统实现其在体外的分泌表达，以期获得活性更高的抗菌肽产品，并能够将含抗菌肽的转基因酵母作为新型兽药加以开发和利用。在本文的研究过程中，首先利用在线工具和数据库查找相应的天然两亲α-螺旋型抗菌肽的一级结构，并统计了其氨基酸序列的分子量、稳定性和亲水性等参数。在此基础上设计了一段多肽DCA。再利用Antherprot等软件分析、确定了此段抗菌肽在理论上具有两亲α-螺旋结构，因此可能具有抗菌等活性，具备研究价值。在此基础上，根据毕赤酵母偏爱密码子推导出该段多肽的基因序列，由两条3’-末端互补的寡聚核苷酸长链通过酶促PCR反应合成目的片段。然后将其插入到含有α-信号肽和AOX1基因的巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoRI位点中，构建能够表达该段小肽的重组质粒pPIC9K-DCA，并在大肠杆菌JM109中扩增繁殖，经PCR检测筛选及5’-端核苷酸测序，确认获得的重组载体中正确插入了设计的目的片段。于是通过电转化的方法将线性化的重组载体整合到毕赤酵母受体菌GS115中，通过MD板、YPD／G418板和酵母菌落PCR等步骤逐步筛选转化子。选择一株耐受2.0mg／mLG418的多拷贝转化子在摇瓶中小量诱导表达，用0.5％～1％的甲醇进行诱导。取不同诱导时间的表达上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析，以GS115／pPIC9K菌株的诱导物为对照，确认目的蛋白已经获得分泌表达。初步检测得知在72h时表达量最高，诱导上清中蛋白浓度为0.566mg／mL，通过对电泳条带的分析，计算出目的片段占总分泌蛋白的35.2％～57.2％。用纸片扩散法检测到该表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球均有抑菌活性，对大肠杆菌的抑菌活性高于金黄色葡萄球菌。综上所述，通过本试验的研究，最终获得了一株抗菌肽转基因酵母菌。

论文目录

• 摘要
• 1 引言
• 1.1 昆虫抗菌肽简介
• 1.1.1 昆虫抗菌肽的分类
• 1.1.2 抗菌肽的作用机制
• 1.1.3 果蝇抗菌肽的介绍
• 1.2 抗菌肽分子设计
• 1.2.1 两亲性和阳离子性原则
• 1.2.2 简化原则
• 1.2.3 需考察的因素
• 1.3 毕赤酵母表达系统的概述
• 1.3.1 与其他表达系统相比,毕赤酵母菌表达系统具有以下特点
• 1.3.2 密码子偏好
• 1.3.3 宿主菌
• 1.3.4 表达载体
• 1.3.5 影响表达的因素
• 2 抗菌肽的设计及结构分析
• 2.1 材料
• 2.2 分析工具
• 2.3 方法
• 2.3.1 分析氨基酸序列
• 2.3.2 分析二级结构
• 2.3.3 分析整体的两亲性和疏水性
• 2.4 结果
• 2.4.1 氨基酸序列的比对
• 2.4.2 设计抗菌肽的分析
• 2.4.3 设计抗菌肽分子的二级结构分析
• 2.4.4 整体两亲性及疏水性预测
• 2.4.5 模拟抗菌肽二级结构
• 3 抗菌肽基因的合成及表达载体pPIC9K-DCA的构建
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 酶及生物试剂
• 3.1.3 化学试剂及厂家
• 3.1.4 主要仪器和设备
• 3.1.5 试剂和培养基
• 3.2 方法步骤
• 3.2.1 抗菌肽DCA的基因序列设计
• 3.2.2 抗菌肽DCA的基因序列合成
• 3.2.3 PCR产物纯化及回收
• 3.2.4 目的片段的PCR产物和载体pPIC9K的限制性内切酶反应
• 3.2.5 目的片断的酶切产物和载体pPIC9K酶切产物的连接
• 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.7 连接产物转化大肠杆菌
• 3.2.8 筛选阳性重组子
• 3.3 结果
• 3.3.1 目的片段的合成
• 3.3.2 PCR产物纯化和回收
• 3.3.3 目的片段和载体的酶切及连接
• 3.3.4 筛选阳性重组子
• 4 重组酵母菌GS115/pPIC9K-DCA的制备及诱导表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株及质粒
• 4.1.2 酶及生物试剂
• 4.1.3 化学试剂及厂家
• 4.1.4 主要仪器和设备
• 4.1.5 试剂和培养基
• 4.2 GS115/pPIC9K-DCA的制备及筛选
• 4.2.1 制备毕赤酵母GS115感受态细胞
• 4.2.2 重组质粒pPIC9K-DCA的线性化
• 4.2.3 电转化
• 4.2.4 初筛
• 4.2.5 复筛
• 4.2.6 Mut表型的鉴定
• 4.3 重组酵母菌的诱导及表达产物的检测
• +Mut⁺表型重组酵母的诱导'>4.3.1 His⁺Mut⁺表型重组酵母的诱导
• 4.3.2 蛋白浓度的测定
• 4.3.3 表达产物的浓缩
• 4.3.4 Tricine-SDS-PAGE电泳
• 4.3.5 表达产物的体外抑菌活性实验
• 4.4 结果
• 4.4.1 质粒线性化结果
• 4.4.2 酵母重组子的的筛选
• 4.4.3 重组酵母菌的诱导表达及检测
• 4.4.4 表达量的测定
• 4.4.5 抑菌活性的检测
• 5 小结与讨论
• 5.1 多肽的设计
• 5.2 抗菌肽的合成
• 5.3 重组表达载体的构建
• 5.4 酵母菌的转化、诱导和表达
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢
• 附发表文章