优质棉纤维发育品质相关基因的分离、克隆、鉴定与定位

论文摘要

棉花是世界重要的经济作物之一。棉纤维是棉子上的一种表皮毛,也是重要的经济价值之所在,是纺织工业的原料。优良的纤维品质是世界棉花育种的主要目标之一。因此,从分子水平阐明棉纤维发育的机理,具有重要的理论价值与现实意义。本研究的目的即利用基因芯片方法筛选与棉纤维品质相关的EST,并分离和鉴定部分棉纤维发育相关基因,这些研究将有助于我们进一步探讨形成优质纤维的分子机理。构建高强纤维种质系7235开花后5-25天棉纤维伸长、次生壁加厚期间的cDNA文库,随机大规模测序,获得1436条EST,制成基因芯片。提取7235和纤维品质一般的陆地棉遗传标准系TM-1不同发育时期的mRNA与之杂交,筛选到31条差异表达EST,主要是参与代谢、次级代谢、胁迫与抗逆、转录等相关基因。通过RT-PCR验证,23条差异表达EST与基因芯片实验结果一致。为了进一步定位这些差异表达EST并分析其与纤维品质性状的相关性,我们分析了所有差异表达EST在7235与TM-1间的多态性。结果表明,三条EST在7235与TM-1间存在多态。利用（7235×TM-1）RIL群体,对这三条EST进行染色体定位及单标记分析,结果表明,两条EST（分别编码LTP基因与ADH基因）与纤维品质性状极显著相关。由于大部分基因在7235与TM-1间不存在差异,所以,我们利用[（TM-1×Hai 7124）×TM-1]群体对其进行定位。结果表明,13条差异表达EST被定位到四倍体棉花遗传图谱的相应染色体上,其中8条EST定位在品质相关QTL区间或附近。通过基因芯片技术,我们鉴定了一条可能编码谷氨酰胺合成酶的EST。Northern杂交验证了该基因在7235与TM-1开花后8天的胚珠和纤维中表达有显著差异。随后,利用7235纤维cDNA文库测序,结合5′RACE技术从7235纤维中获得了全长谷氨酰胺合成酶基因。序列分析结果表明,该基因与已报道的其他植物的细胞质谷氨酰胺合成酶（GS1）基因具有较高氨基酸序列同源性,命名为GhGS。Southern blot分析结果表明,GhGS在陆地棉基因组的A、D亚基因组可能各存在一个拷贝。之后,从不同材料7235、TM-1、非洲棉、雷蒙德氏棉基因组中分离到GhGS基因序列。根据7235与TM-1基因组GhGS序列的SNP,将该基因在（7235×TM-1）RIL群体中进行定位并分析基因与纤维表型的相关性,结果发现,GhGS与纤维强度存在相关,但由于该RIL图谱上的位点较少,GhGS基因不能整合到该图谱上。随后,利用[（TM-1×Hai 7124）×TM-1]群体,将GhGS基因定位在四倍体棉花遗传图谱的D7染色体上。另外,我们测定了棉纤维发育不同时期胚珠和纤维的GS活力和总蛋白含量。测定结果表明,在开花后5天和8天的7235胚珠GS活力显著高于TM-1相应时期的胚珠GS活力。同时发现,开花后11天的7235胚珠总蛋白含量和胚珠重量都显著高于同时期TM-1胚珠总蛋白含量和重量。这一结果暗示GS可能通过提供N而促使棉花种子的形成。而在纤维中的测定结果表明,在7235中GS活力和总蛋白含量都低于TM-1中的GS活力和总蛋白含量。这一结果暗示GS在胚珠和纤维中行使的功能可能并不完全相同。GS在纤维发育过程中的可能功能还需进一步探讨。另一个克隆的基因为脂肪酶基因。通过对7235纤维cDNA文库测序,获得一个可能编码脂肪酶的cDNA片段。随后,利用RACE技术获得该cDNA全长并命名为GhLipase。序列分析结果表明,GhLipase全长1286bp,包含一个编码368个氨基酸的开放读码框。BLAST分析表明,它与已报道的其他植物的脂肪酶基因具有较高的氨基酸序列同源性。从表达特征看,GhLipase在胚珠和纤维细胞优势表达,而且在开花后5-17天的纤维中表达水平较高。Southern blot结果表明,GhLipase基因在陆地棉基因组中可能存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A13染色体上。第三个利用7235cDNA文库分离的基因为木聚糖水解酶基因。该cDNA全长1790bp,ORF编码560个氨基酸。CDS分析表明,GhXyl基因推导的氨基酸含有糖基水解酶家族10的保守区域,具有典型的糖基水解酶家族10基因结构,BLAST结果表明其与来源于其他植物的木聚糖水解酶有较高的同源性,命名为GhXyl基因。RT-PCR和Northern blot分析结果表明,GhXyl属纤维细胞优势表达,且在开花后5-8天的纤维中表达水平最高。Southern杂交结果表明木聚糖水解酶基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A3染色体上。本研究利用7235纤维cDNA文库,还分离到六个小分子质量的热激蛋白基因,分别命名为LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3、LMWHSP4、LMWHSP5、LMWHSP6。分析它们的序列结构,发现它们分别属于三种不同类型的小热激蛋白,LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP4、LMWHSP6都与细胞质Ⅰ类热激蛋白序列同源性较高,而LMWHSP3与细胞质Ⅱ类热激蛋白序列同源性较高,LMWHSP5与线粒体热激蛋白序列同源性较高。对这六个小分子质量热激蛋白基因进行转录表达分析,结果表明,它们在棉花体内具有不同的表达特征,LMWHSP2是组成型表达的基因,LMWHSP 1、LMWHSP 4、LMWHSP5、LMWHSP6都在开花当天的胚珠中表达量最高,而LMWHSP3在棉花叶片中优势表达。这一结果暗示,线粒体小热激蛋白和细胞质Ⅰ类小热激蛋白基因可能受纤维启始和分化的调控,而细胞质Ⅱ类小热激蛋白与棉花叶片的生长发育相关。利用本实验室的四倍体棉花遗传图谱,对这六个小热激蛋白基因进行定位,其中三个基因LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3分别被定位在A4、D8和A6染色体上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 棉纤维发育相关EST与基因研究进展
• 1.棉纤维发育EST研究
• 1.1 EST基本概念
• 1.2 EST的获取
• 1.3 EST的应用
• 1.3.1 构建遗传学图谱
• 1.3.2 提供DNA芯片的基因资源
• 1.3.3 发现和鉴定新基因
• 1.3.4 基因差异表达的研究
• 1.3.5 用于克隆新基因
• 1.4 棉纤维发育相关EST研究进展
• 2.棉纤维发育相关基因研究
• 第二章 基因芯片技术研究进展
• 1.基因芯片技术的概念及原理
• 2.基因芯片技术的产生背景与发展
• 2.1 基因芯片概念的提出与产生背景
• 2.2 基因芯片技术的发展
• 2.3 基因芯片技术在我国的发展
• 3.基因芯片的分类
• 4.基因芯片技术在作物研究中的应用
• 4.1 基因组测序
• 4.2 寻找新基因
• 4.3 检测基因表达水平
• 4.4 突变性和多态性检测
• 4.5 后基因组学研究
• 4.6 转基因农产品检测和植物检疫
• 4.7 其他方面
• 5.基因芯片技术在棉花研究中应用与进展
• 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究报告
• 第三章 棉纤维品质相关EST的鉴定与定位
• 1.材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 cDNA文库的构建
• 1.3 cDNA芯片的制备与杂交
• 1.3.1 芯片制备
• 1.3.2 探针标记
• 1.3.3 杂交与洗涤
• 1.3.4 检测和数据分析
• 1.4 ESTs的序列分析和功能分类
• 1.5 RT-PCR验证
• 1.5.1 RNA的提取
• 1.5.2 总RNA的DNase Ⅰ消化
• 1.5.3 cDNA第一链的合成
• 1.5.4 RT-PCR
• 1.6 利用（7235×TM-1）重组自交系的基因定位及其与纤维品质性状的相关性分析
• 1.6.1 DNA的提取
• 1.6.2 纤维品质测定
• 1.6.3 DNA分子标记试验及数据分析
• 1.6.4 单标记分析
• 1.7 利用[（TM-1×Hai7124）×TM-1]群体的基因定位
• 1.8 染色体命名
• 2.结果和分析
• 2.1 EST序列信息
• 2.2 杂交表达谱与差异表达基因的功能预测
• 2.3 基因芯片结果的RT-PCR验证
• 2.4 利用（7235×TM-1）RIL的基因定位和纤维品质相关性分析
• 2.5 利用[（TM-1×Hai 7124）×TM-1]群体的基因定位
• 3.讨论
• 3.1 棉纤维发育表达谱研究材料的选择
• 3.2 差异表达ESTs的功能特征
• 3.3 棉花中的乙醇脱氢酶基因（ADH）与脂转移蛋白基因（LTP）
• 3.4 棉纤维品质发育相关基因的染色体分布特点
• 第四章 棉花GhGS基因的克隆和特征分析
• 1.材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 RNA的分离
• 1.3 GhGS全长cDNA的获得和不同品种中GhGS基因的获得
• 1.3.1 GhGS全长cDNA的获得
• 1.3.2 不同品种中基因组GhGS序列的获得
• 1.4 序列分析
• 1.5 Southern杂交分析
• 1.5.1 基因组DNA的酶切
• 1.5.2 试剂及其配制
• 1.5.3 Southern印迹
• 1.5.4 DIG标记探针
• 1.5.5 杂交
• 1.5.6 洗膜与显色
• 1.6 Northern杂交
• 1.6.1 RNA甲醛琼脂糖凝胶变性电泳
• 1.6.2 Northern转膜
• 1.6.3 探针的制备与杂交
• 1.7 GhGS的染色体定位及与纤维品质性状的相关性分析
• 1.7.1 利用（7235×TM-1）重组自交系的基因定位及与纤维品质性状的相关性分析
• 1.7.2 利用[（TM-1×Hai7124）×TM-1]群体的基因定位
• 1.8 GS活性和总蛋白含量的测定
• 1.8.1 GS活性的测定
• 1.8.2 总蛋白含量的测定
• 2.结果与分析
• 2.1 GhGS基因的转录表达
• 2.2 GhGS基因的克隆和序列分析
• 2.2.1 GhGS全长cDNA的获得和序列分析
• 2.2.2 GhGS基因在陆地棉中的拷贝数分析和不同棉花品种GhGS基因的分离
• 2.3 GhGS基因的染色体定位及与纤维品质性状的相关性分析
• 2.4 GS活力和总蛋白含量的测定
• 3.讨论
• 3.1 GS在种子形成中可能起重要作用
• 3.2 纤维中的GS
• 3.3 四倍体棉花中GhGS基因的转录和调控
• 第五章 陆地棉GhXyl基因、GhLipase基因和六个小分子质量热激蛋白基因（HSP）的克隆和特征分析
• 1.材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 RNA的分离
• 1.3 RT-PCR分析
• 1.4 全长cDNA的获得及序列分析
• 1.5 Southern杂交
• 1.6 基因定位
• 2.结果与分析
• 2.1 基因全长的克隆与序列分析
• 2.1.1 GhXyl全长cDNA的克隆与序列分析
• 2.1.2 GhLipase全长cDNA的克隆和序列分析
• 2.1.3 六个小分子质量HSP基因序列分析
• 2.2 RT-PCR分析
• 2.2.1 GhXyl基因的转录表达
• 2.2.2 GhLipase基因的转录表达
• 2.2.3 六个小分子质量HSP基因的转录表达
• 2.3 Southern杂交分析
• 2.3.1 GhXyl基因在陆地棉中的拷贝数
• 2.3.2 GhLipase基因在陆地棉中的拷贝数
• 2.4 基因定位
• 2.4.1 GhXyl基因的定位
• 2.4.2 GhLipase基因的定位
• 2.4.3 三个小分子质量HSP基因的定位
• 3.讨论
• 3.1 GhXly基因在纤维发育过程中的可能功能
• 3.2 GhLipase基因在纤维发育过程中的可能功能
• 3.3 棉花小分子质量HSP的特征及其在纤维发育过程中的可能功能
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢