绒山羊—牛异种核移植胚胎的构建及其组蛋白乙酰化修饰的研究

论文摘要

随着核移植技术的不断发展,异种核移植的研究成为新的热点。异种核移植突破了物种之间的生殖隔离限制,对物种的改良、濒危动物的保护具有十分重要的意义。但目前无论同种还是异种,核移植的效率都很低。有研究表明,供体核的不完全重编程,导致在发育过程中有重要作用的基因没有表达或异常表达,是克隆效率低的主要原因。表观遗传修饰的异常是核移植胚胎重编程异常的主要原因,其中基因组DNA甲基化和组蛋白修饰是重要的表观遗传修饰,二者在调控染色体重构、基因表达中起着重要作用。目前,较多的研究集中在重构胚发育过程中DNA甲基化的重编程,而有关组蛋白乙酰化的研究并不多。为了提高核移植效率,深入研究组蛋白乙酰化修饰对核移植胚胎重编程的影响,本研究以成年绒山羊耳皮肤成纤维细胞为核供体,以牛卵母细胞为核受体构建异种重构胚,对融合条件、激活条件以及培养条件进行了优化,并研究了绒山羊-牛异种重构胚在原核形成过程中组蛋白H3、H4乙酰化修饰模式,进一步比较了同种核移植胚胎与异种核移植胚胎在原核形成过程中组蛋白乙酰化修饰的差异。此外,使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂对卵母细胞和异种重构胚进行处理,探讨了药物处理对重构胚早期发育的影响。1、绒山羊-牛异种核移植体系的建立本研究建立了成年绒山羊耳皮肤成纤维细胞系,对其体外生长特性及核型进行了分析。结果表明,成年绒山羊耳皮肤成纤维细胞在体外培养过程中具有正常的细胞形态、分裂增殖特性以及染色体数目。本研究以体外培养的成年绒山羊耳皮肤成纤维细胞为核供体,以去核牛卵母细胞为受体构建异种重构胚。在核移植操作后不同恢复时期（0.5hr、1.0hr、＞1.0 hr）进行融合;并通过改变电场强度、脉冲时程、脉冲次数等融合参数,探讨了不同处理组合（电场强度180v/mm、脉冲时程20μs、脉冲1次;电场强度180v/mm、脉冲时程20μs、脉冲2次;电场强度190v/mm、脉冲时程20μs、脉冲2次;电场强度190v/mm、脉冲时程30μs、脉冲2次）对融合效率的影响;同时还比较了不同激活剂（7%乙醇联合6-DMAP;A23187联合6-DMAP;Ionomycin联合6-DMAP）对重构胚激活效果的影响。结果表明,在当前的核移植系统中,核移植完成后恢复0.5hr融合,明显提高了重构胚的融合率;使用电场强度为190v/mm,脉冲时长为20μs,2次脉冲的融合条件,可以获得较好的融合效果;使用A23187联合6-DMAP的激活条件能够获得较高的卵裂率和8-细胞率。另外,本研究还对体外培养体系进行了优化。结果显示,采用SOFaa、M199和CR1aa三种发育液单独培养时,异种重构胚均可发育到桑椹胚阶段,且8-细胞重构胚以及桑椹胚的发育率均无显著差异。但综合卵裂率、8-细胞发育率以及桑椹胚发育率来看,CR1aa培养液更有利于绒山羊-牛异种重构胚胎的发育。当采用CR1aa（4%FBS）联合牛颗粒细胞共培养时,成功获得了绒山羊-牛异种核移植囊胚,囊胚率为3.55%,初步建立了绒山羊-牛异种核移植体系。2、TSA处理对异种重构胚发育的影响Trichostatin A（TSA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可以特异地抑制组蛋白去乙酰化酶的活性,增加供体核的组蛋白乙酰化水平,增强基因表达。本研究使用TSA处理卵母细胞或重构胚,探讨了药物处理对异种重构胚早期发育的影响。结果表明,使用含1ng/ml TSA的成熟液体外成熟培养牛卵母细胞18hr,然后用于核移植,可显著提高桑囊率（18.26%vs 8.62%,P＜0.05）,但是卵裂率及8-细胞发育率没有显著差异（P＞0.05）;分别使用不同浓度TSA（1ng/ml、10ng/ml）处理异种重构胚4hr（从激活时算起）,发现各试验组（1ng/ml、10ng/ml）与对照组在8-细胞率及桑囊率上均无显著差异（P＞0.05）,仅在卵裂率上,1ng/mlTSA处理组与10ng/ml TSA处理组存在极显著的差异（66.67%vs 50.60%,P＜0.01）;使用1ng/ml TSA分别处理异种重构胚4hr和24hr,各处理组（4hr、24hr）与对照组之间在卵裂率及8-细胞率上均无显著差异（P＞0.05）,但使用TSA处理异种重构胚24hr后显著地降低了桑囊率（4.79%vs 13.68%,P＜0.05）,说明较长时间的TSA处理将影响绒山羊-牛核移植重构胚的正常发育。3、异种重构胚1-细胞期组蛋白乙酰化重编程的研究组蛋白修饰是重要的表观遗传修饰,在调控染色体重构、基因表达中起着重要作用。本研究利用荧光免疫化学方法检测了绒山羊-牛异种核移植胚胎1-细胞期组蛋白H3K9、H3K18和H4K8乙酰化的动态变化,并与牛同种核移植胚胎在1-细胞期组蛋白乙酰化的动态变化进行了比较。结果显示,两种重构胚具有一致的组蛋白乙酰化修饰模式,即供体核发生早期染色体凝集,组蛋白H3K9、H3K18去乙酰化;重构胚被激活,组蛋白H3K9、H3K18重新被乙酰化。而组蛋白H4K8却表现出不同的变化模式,即早期染色体凝集时仅发生部分的去乙酰化。同种与异种重构胚具有一致的组蛋白乙酰化修饰模式,说明牛卵母细胞对不同种属体细胞组蛋白乙酰化的重编程并没有差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 一 利用核移植技术制备绒山羊-牛异种核移植胚胎
• （一） 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 活体材料
• 1.3 试剂及耗材
• 1.4 溶液配方
• 2 研究方法
• 2.1 成年绒山羊耳皮肤成纤维细胞的分离与体外培养
• 2.2 绒山羊-牛异种核移植胚胎的构建
• 2.3 统计分析
• （二） 结果
• 1 组织块贴附法分离培养绒山羊成纤维细胞
• 2 绒山羊耳尖成纤维细胞生长曲线的测定
• 3 绒山羊成纤维细胞核型分析
• 4 卵母细胞的采集和体外成熟
• 5 不同融合条件对异种重构胚融合效率的影响
• 6 不同激活条件对异种重构胚发育的影响
• 7 不同培养条件对异种重构胚发育的影响
• （三） 讨论
• 1 供体细胞的准备
• 2 受体卵母细胞的准备与去核
• 3 重构胚的融合与激活
• 4 重构胚的体外培养
• （四） 结论
• 图版
• 参考文献
• 二 TSA处理对异种重构胚发育的影响及1-细胞期组蛋白乙酰化重编程的研究
• （一） 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 活体材料
• 1.3 试剂及耗材
• 1.4 溶液配方
• 2 研究方法
• 2.1 成年绒山羊耳尖成纤维细胞的分离与体外培养
• 2.2 绒山羊-牛异种核移植胚胎的构建
• 2.3 不同时期胚胎的收集
• 2.4 荧光免疫化学实验
• 2.5 组蛋白乙酰化重编程的研究
• 2.6 不同TSA处理对重构胚发育的影响
• （二） 结果
• 1 TSA处理卵母细胞对重构胚发育的影响
• 2 不同浓度TSA处理重构胚对其发育的影响
• 3 TSA处理不同时间对重构胚发育的影响
• 4 卵母细胞重编程能力的研究
• （三） 讨论
• （四） 结论
• 参考文献
• 附表
• 哺乳动物异种核移植研究进展
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文