SSH筛选济宁青山羊性早熟相关基因及KiSS-1、GPR54、Lin28B基因的研究

论文摘要

本研究分为两部分:第一部分:缩短母羊的初情期,有助于减少后备母羊的生产投入。济宁青山羊是一个性早熟的山羊品种。本部分研究旨在利用抑制消减杂交技术（SSH）筛选济宁青山羊性早熟相关基因,为进一步深入开展山羊性早熟的分子机理研究及通过遗传选择缩短山羊初情期提供理论基础。应用抑制消减杂交技术成功构建了济宁青山羊与辽宁绒山羊幼年期、初情期、初情期同龄对照间下丘脑、垂体、卵巢-子宫、肾上腺的消减cDNA文库,并对差异表达基因进行了生物信息学分析。取得结果如下:1.应用SSH技术构建济宁青山羊与辽宁绒山羊幼年期、初情期、初情期同龄对照间下丘脑、垂体、卵巢-子宫、肾上腺共12个正向消减cDNA文库,以GAPDH为指标检测消减文库的消减效率在25以上,表明差异表达基因得到了有效的富集。经PCR和测序鉴定,插入片段大小在250-900 bp之间。2. 12组消减文库中共获得2046条差异表达EST,其中包括幼年期698条、初情期对照623条、初情期725条,在每个发育时期下丘脑和垂体中获得的差异表达EST多些,卵巢-子宫和肾上腺中较少一些。对各组差异表达EST按照已知基因、已知EST和未知EST进行了分类,并对差异表达EST进行了出现频次统计。3.将各组已知基因进行了在线功能分类。根据PANTHER数据库分析,差异表达基因主要涉及信号转导与细胞间通讯、物质转运、复制/转录/翻译相关、细胞结构与运动、代谢、细胞与机体防御。根据COG分类结果,获得的差异表达基因涉及细胞进程与信号、信息储存与加工、代谢3大类,含16小类。4.将已知基因提交KEGG Pathway数据库进行通路分析,发现差异表达基因参与最多的是Metabolic pathways,其次是Parkinson’s disease和Oxidative phosphorylation。5.将已知基因进行蛋白质互作关系分析,发现获得的差异表达基因形成了核糖体结构/蛋白质翻译和氧化磷酸化两个主要的作用网络。第二部分:KiSS-1和GPR54是调控动物初情期启动的重要基因。Lin28B基因内或附近的变异与女孩月经初潮年龄在基因组水平上相关。本部分研究旨在寻找新的山羊性早熟相关基因,了解其作用机制,期望能够用于缩短山羊初情期的分子育种。试验一:克隆了山羊KiSS-1基因4118 bp的序列,预测含408 bp的ORF,编码135 aa。该蛋白质含有一个17 aa的信号肽,是一个分泌型蛋白。其序列与牛、绵羊的同源性较高,分别为91.11%和95.24%,与人、小鼠、大鼠、猪的同源性较低,分别为60.53%、58.12%、59.66%、72.50%。在山羊KiSS-1内含子1中发现3个突变位点（G296C、G454T和T505A）,外显子2中没有发现突变位点,内含子2中发现一个18 bp缺失（-）/插入（+）突变（1960-1977）,外显子3中发现两个突变位点（G3433A[A86T]和C3688A）。这些突变位点在性早熟和性晚熟山羊品种之间的基因型分布没有规律性差异。296位点CC型济宁青山羊产羔数比GG、GC型分别多0.80只（P<0.01）和0.77只（P<0.01）,GG与GC基因型个体间产羔数差异不显著。1960-1977位点-/-个体比+/+、+/-个体产羔数分别多0.77只(P<0.01和0.73只（P<0.01）,+/+与+/-间差异不显著。其他4个位点基因型间产羔数差异不显著。本研究初步表明山羊KiSS-1基因296位点C等位基因和1960-1977位点的（-）等位基因可能与济宁青山羊的高产羔数有关。试验二:克隆了山羊GPR54基因4258 bp的序列,预测含1137 bp的ORF,编码378 aa,含有7个跨膜域。该蛋白序列与牛、绵羊的同源性最高,分别为94.57%和99.58%,和人、小鼠、大鼠、猪的同源性较高,分别为86.69%、84.88%、82.47%、88.99%。山羊GPR54基因外显子1-4上没有发现突变位点,外显子5上发现3个突变位点(G4014A[G328D]、G4136A[G368S]和C4152T[P373L],这3个突变位点可能与济宁青山羊的性早熟有一定关系。4152位点的TT和CT型济宁青山羊产羔数比CC型分别多1.02 （P<0.01）和0.84（P<0.01）,TT与CT基因型个体间产羔数差异不显著。其他两个位点基因型间产羔数差异不显著。本研究初步表明山羊GPR54基因4152位点T等位基因可能与济宁青山羊的高产羔数有关。试验三:克隆获得山羊Lin28B基因mRNA序列916 bp,含有744 bp的CDS区,编码247 aa,预测山羊Lin28B蛋白含有一个冷休克结构域和一对锌指结构域。该蛋白序列与人、猕猴、大鼠、小鼠、牛的同源性分别为90. 80%、90.32%、76.19%、76.92%和94.09%。山羊Lin28B存在可变剪接,剪接位点发生在内含子3中,并且内含子3的3’-端含有一个微卫星序列。测序在外显子1-3上未发现突变位点,在外显子4上发现9个突变位点（G911A、C1026T、A2934T、C3053T、G3248A、C3414G、A3770T、C4478T和G4742A）,全部位于3’-UTR。对其中8个位点在12个山羊品种中进行了检测,这8个位点的基因型分布在性早熟山羊品种和性晚熟山羊品种中没有明显规律。2934位点TT和AT基因型济宁青山羊产羔数比AA基因型分别多0.83只（P<0.01）和0.48只（P<0.05）,TT与AT基因型个体间差异不显著,另外7个位点基因型个体间产羔数差异不显著。本研究初步表明山羊Lin28B基因2934位点T等位基因可能与济宁青山羊的高产羔数有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 初情期
• 1.1.1 初情期定义
• 1.1.2 判断初情期的方法
• 1.1.3 遗传参数：遗传力、遗传相关和重复力
• 1.1.4 青春期的神经内分泌
• 1.1.5 青春期的调控机制
• 1.2 KiSS-1 和 GPR54 基因研究进展
• 1.2.1 基因概况
• 1.2.2 表达情况
• 1.2.3 功能
• 1.3 Lin28B 基因研究进展
• 1.3.1 基因概况
• 1.3.2 表达情况
• 1.3.3 功能
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 抑制消减杂交筛选济宁青山羊性早熟相关基因
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物和样品采集
• 2.1.2 克隆用载体和菌株
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 抑制消减杂交所用试剂盒及主要试剂
• 2.1.5 引物序列
• 2.1.6 主要数据库
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 主要试剂配制
• 2.2.2 总RNA 制备
• 2.2.3 mRNA 提取
• 2.2.4 RNA 质量和浓度检测
• 2.2.5 抑制消减杂交
• 2.2.6 消减文库构建
• 2.2.7 阳性克隆的测序
• 2.2.8 差异表达EST 序列生物信息学分析
• 2.3 实验结果与分析
• + RNA 纯化及检测'>2.3.1 总RNA 提取、Poly A ⁺ RNA 纯化及检测
• 2.3.2 双链cDNA（dscDNA）合成与酶切
• 2.3.3 接头连接效率检测
• 2.3.4 消减产物的PCR 扩增
• 2.3.5 消减效率检测
• 2.3.6 消减文库中插入片段的PCR 鉴定
• 2.3.7 各组消减产物克隆测序及生物信息学分析
• 2.3.8 重要候选基因
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于抑制消减杂交
• 2.4.2 关于抑制消减杂交组设计
• 2.4.3 差异表达基因
• 2.5 小结
• 第三章 性早熟候选基因KiSS-1的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物与样品采集
• 3.1.2 克隆载体与菌株
• 3.1.3 重要仪器与设备
• 3.1.4 主要酶和试剂
• 3.1.5 主要数据库和生物软件
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 主要试剂配制的方法
• 3.2.2 血液基因组的提取
• 3.2.3 引物设计
• 3.2.4 目的片段的扩增及检测
• 3.2.5 克隆与测序
• 3.2.6 序列的生物信息学分析
• 3.2.7 多态性扫描和检测
• 3.2.8 统计分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 山羊KiSS-1 基因序列分析
• 3.3.2 多态性检测
• 3.3.3 KiSS-1 基因在不同山羊品种中的遗传多态性
• 3.3.4 不同山羊品种KiSS-1 基因型分布差异检验
• 3.3.5 固定效应对济宁青山羊产羔数的影响
• 3.4 讨论
• 3.4.1 山羊 KiSS-1 基因序列
• 3.4.2 山羊 KiSS-1 基因多态性
• 3.4.3 山羊 KiSS-1 基因和性早熟的关系
• 3.4.4 山羊 KiSS-1 基因和产羔数的关系
• 3.5 小结
• 第四章 性早熟候选基因GPR54 的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验动物与样品采集
• 4.1.2 菌株和载体
• 4.1.3 主要仪器和设备
• 4.1.4 主要酶和试剂
• 4.1.5 主要数据库及生物软件
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 常用试剂的配制
• 4.2.2 血液基因组的提取
• 4.2.3 引物设计
• 4.2.4 目的片段的扩增及检测
• 4.2.5 克隆和测序
• 4.2.6 序列生物信息学分析
• 4.2.7 多态性扫描和检测
• 4.2.8 统计分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 山羊 GPR54 基因序列克隆及分析
• 4.3.2 多态性检测
• 4.3.3 GPR54 基因在不同山羊品种中的遗传多态性
• 4.3.4 不同山羊品种GPR54 基因型分布差异检验
• 4.3.5 固定效应对济宁青山羊产羔数的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 山羊 GPR54 基因序列
• 4.4.2 山羊 GPR54 基因多态性
• 4.4.3 山羊 GPR54 基因和性早熟的关系
• 4.4.4 山羊 GPR54 基因和产羔数的关系
• 4.5 小结
• 第五章 性早熟候选基因Lin28B 的研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验动物与样品采集
• 5.1.2 菌株和载体
• 5.1.3 主要仪器和设备
• 5.1.4 主要酶和试剂
• 5.1.5 主要数据库及生物软件
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 常用试剂的配制
• 5.2.2 血液基因组的提取
• 5.2.3 引物设计
• 5.2.4 目的片段的扩增及检测
• 5.2.5 克隆和测序
• 5.2.6 序列生物信息学分析
• 5.2.7 多态性检测
• 5.2.8 统计分析
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 山羊Lin28B 基因序列克隆及分析
• 5.3.2 山羊 Lin28B 基因多态性检测
• 5.3.3 Lin28B 基因在不同山羊品种中的遗传多态性
• 5.3.4 不同山羊品种中Lin28B 基因型分布差异检验
• 5.3.5 Lin28B 基因与济宁青山羊产羔数的关系
• 5.4 讨论
• 5.4.1 山羊 Lin28B 基因序列
• 5.4.2 山羊 Lin28B 基因多态性
• 5.4.3 山羊 Lin28B 基因与山羊性早熟的关系
• 5.4.4 山羊 Lin28B 基因与济宁青山羊产羔数的关系
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介