论文摘要
神经母细胞瘤的发病多是由于基因缺陷引起,包括MYCN基因的扩增,1号染色体短臂的缺失,11号染色体长臂的缺失和17号染色体长臂的增添（gain）。其中,以17号染色体长臂的增添在高风险神经母细胞瘤中最为常见,然而有关候选基因的作用机理至今仍不清楚。在本研究中,我们利用细菌人工染色体（BAC）基因芯片对236例神经母细胞瘤样本进行了比较基因组杂交（array-Comparative Genomic Hybridization,array-CGH）分析,利用涵盖5340个cDNA的基因芯片对136例神经母细胞瘤样本进行基因表达谱分析。综合上述数据,结果发现位于人17号染色体2区5段1带（17q25.1）存在一个新基因。该基因从未被报道过,通过鉴定发现该基因有2个剪切体,即Nbla10727和Nbla12061。Northern Blot结果提示该基因mRNA转录长度大约为2.3kb,生物信息学分析结果显示该基因不含有长的开放阅读框架（Open Reading Frame,ORF）,而[35S]-标记的体内、体外翻译实验结果显示该基因不能产生任何的蛋白质产物。这些结果提示了该基因为非编码RNA,由于临床数据显示该基因在恶性度高、预后差的神经母细胞瘤里异常高表达,因此取名为ncRAN（non-coding RNA expressed in Aggressive Neuroblastoma）。对70例散发神经母细胞瘤病例进行基因表达谱分析显示,该基因的mRNA高表达与患者的不良预后存在明显的相关性（p<0.001）。多因素分析结果显示ncRAN的mRNA表达是不依赖于发病年龄、肿瘤的分期、肿瘤原发灶以及MYCN基因的扩增,而存在的独立预后因素。软琼脂克隆形成实验证明外源性表达ncRAN能够诱导小鼠成纤维细胞系（NIH3T3）产生细胞集落。沉默ncRAN基因后,神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y生长明显受到抑制。由此鉴定,ncRAN基因是定位于人17号染色体上的长的非编码RNA,并在神经母细胞瘤中具有癌基因的特性。实验方法一、临床资料收集的神经母细胞肿瘤样本来自日本多个医疗机构,经手术或是送检而得。236例神经母细胞瘤样本用于比较基因组杂交技术分析,136例样本用于基因表达谱的分析,其中各有112例和70例散发病例。临床标本根据国际神经母细胞瘤分期系统（INSS）进行分类。70例散发病例中临床Ⅰ期15例,Ⅱ期8例,Ⅲ期17例,Ⅳ期25例,Ⅳs期5例,该样本的表达分析用于Kaplan-Meier生存曲线分析。本病例中相对应的MYCN扩增情况已在发表文章中报道。二、方法1、比较基因组杂交技术（array-CGH）和表达谱基因芯片技术利用包涵整个人类基因组的2464个细菌人工染色体（BAC）克隆的生物芯片,对236例神经母细胞瘤进行比较基因组杂交技术分析,分辨率小于1.2Mb。从临床分期不同的神经母细胞瘤组织提取RNA,通过oligo-capping法建立cDNA文库获得5340个cDNA,对136例神经母细胞瘤进行基因表达谱分析,该芯片仅限于日本千叶癌中心研究局的相关神经母细胞瘤研究。比较基因组杂交（array-CGH）和表达谱基因芯片的相关数据可以登录美国国家生物技术信息中心（NCBI）高通量基因表达数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）进行查询。相应数据库编号分别为GSE5784和GSE5779。2、细胞培养和转染用含10%灭活胎牛血清及抗生素的DMEM培养基或是RPMI1640培养基对NIH3T3和COS7以及人神经母细胞瘤细胞系进行培养。培养环境为37℃,CO2分压为5%的细胞培养箱。根据厂家说明,用Lipofectamine2000（Invitrogen）进行COS7和NIH3T3细胞的瞬时转染。3、质粒构建在原发神经母细胞瘤cDNA文库中,克隆出Nbla10727和Nbla12061的cDNA全长,并将其插入到真核表达载体pcDNA3或是pcDNA3-FLAG质粒中。4、体外转录和翻译利用TNT T7 Quick coupled transcription/translation system（Promega）,根据产品说明用[35S]-标记甲硫氨酸对蛋白产物进行标记。之后,对相应的蛋白产物进行SDS-PAGE凝胶电泳和放射自显影检测。5、[35S]-蛋白标记将含有FLAG-ncRAN和HA-MEL1的表达载体瞬时转入COS7细胞系。24小时后,1xPBS润洗细胞三次后,加入不含甲硫氨酸和抗生素的新鲜培养基。2小时后,加入浓度为0.1mCi/ml[35S]-标记甲硫氨酸的培养基,继续培养。收集细胞后,全细胞裂解液用于免疫共沉淀,进行SDS-PAGE凝胶电泳和放射自显影检测。6、RNA分离及半定量PCR利用AGPC法将total RNA从冷冻组织中分离出来。按照试剂盒说明,利用逆转录系统,在系统中加入随机引物和SuperScriptⅡ逆转录酶,将5μg total RNA用于合成DNA的第一条链。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为定量对照,将各个样品进行稀释至同一浓度。聚合酶链反应（PCR）为28个循环,95℃预热2min,95℃变性15sec,55℃退火15sec,72℃延伸20sec。7、Northen Blot实验收集神经母细胞瘤细胞total RNA 20μg进行变性电泳,转膜之后,进行紫外交联固定,将标记有[α-32p]-dCTP的探针,与硝酸纤维素膜进行杂交用于检测。8、软琼脂克隆形成实验将FLAG-ncRAN及相应的空载体质粒瞬时转染至小鼠成纤维细胞NIH3T3中,将转染后的细胞重悬至含10%胎牛血清、0.33%（wt/vol）低沸点琼脂的DMEM培养基,密度为500个细胞/培养皿（D=35mm）,均匀种进已铺好含0.5%（wt/vol）琼脂DMEM培养基里。在37℃CO2分压为5%的细胞培养箱内培养,14天后在显微镜下,计数阳性克隆数（阳性克隆直径>100μm）。9、RNA干扰实验将带有Sac I和Xho I酶切位点且能干扰ncRAN基因表达的寡核苷酸连接至pMuni空载体上。寡核苷酸序列为5＇-CCCCATCCTCTAGTAGCCACGGTTTCAAGAGAACCGTGGCTACTAGAGGATTTTTTGGAAAC-3＇and5＇-TCGAGTTTCCAAAAAATCCTCTAGTAGCCACGGTTCTCTTGAAACCGTGGCTACTAGAGGATGGGGAGCT-3＇。利用Lipofectamine2000（Invitrogen）将含有寡核苷酸的质粒瞬时转入SH-SY5Y细胞系中。三、统计方法t-检验用于分析ncRAN的表达与其他因素的可能相关性,例如发病年龄等等。见累积后的生存病例进行Kaplan-Meier曲线和log-rank检验分析。单因素和多因素分析采用Cox风险比例模型。因为ncRAN基因的表达情况来自5340个基因样本的芯片,所以考虑q值。在数据统计中,p<0.05被认为有统计学意义。结果1、在神经母细胞瘤中发现一个新基因ncRAN-Nbla10727/12061,定位于人类染色体17q25.1,而且在侵袭性神经母细胞瘤中ncRAN有异常高的表达。为了筛选侵袭性神经母细胞瘤的治疗靶点,我们对高风险肿瘤样品进行了基因组学的特异性调查。本研究利用承载2464个细菌人工染色体（BAC）克隆的生物芯片对236例神经母细胞瘤病例进行了比较基因组杂交（array-CGH）分析,结果发现17号染色体的增添与患者预后有着明显的关系。同时也利用含有5340个cDNA的基因芯片对136例神经母细胞瘤病例的相关基因表达进行分析。结果发现位于人17号染色体2区5段1带（17q25.1）存在一个新基因。该基因从未被报道过,通过对该基因的鉴定,发现其有2个变构体,即Nbla10727和Nbla12061。2、noRAN-Nbla10727/12061的高表达与神经母细胞瘤的预后不良有着密切的相关性。在预后良好的神经母细胞瘤样本（即INSS分期为I期,发病年龄小于1岁,MYCN单拷贝,且TrkA基因高表达）中随机选择8例病例。在预后差的神经母细胞瘤样本（即INSS分期为Ⅲ或Ⅳ期,发病年龄大于1岁,MYCN多拷贝,且TrkA基因低表达）中随机选择8例病例。利用半定量PCR,对上述两实验组进行比较后发现ncRAN在预后差组表达明显高于预后良好组。利用生物芯片对ncRAN-Nbla10727、Nbla12061在70例散发神经母细胞瘤病例中的表达分析,结果显示ncRAN基因表达水平与不良预后存在正相关（log-rank检验,p值分别为0.000221和0.005728）。多因素分析采用Cox风险比例模型。结果显示,ncRAN基因的表达水平可作为独立预后因子。3、能够促进神经母细胞瘤细胞的生长,而且能够诱导NIH3T3细胞转化,使其具有癌细胞的特性。将能够沉默ncRAN基因表达的质粒转入神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y 24小时后,描绘细胞生长曲线。结果表明细胞生长速度明显减慢。软琼脂克隆形成实验证明了ncRAN基因具有原癌基因的特性。4、ncRAN基因不能编码蛋白。Northern Blot证实了ncRAN基因的mRNA真实存在而且全长约为2.3kb。体内、体外转录翻译实验都证实ncRAN基因没有编码任何蛋白质产物。利用生物信息学分析,ncRAN基因有完整的基因结构但不含有长的开放阅读框。在与其他物种进行基因组比对发现,ncRAN基因只在灵长类存在同源基因,且相似度均在90%以上。结论1、ncRAN基因经鉴定后,确定其为首次报道的一个新基因,定位于人17q25.1,并与神经母细胞瘤的发病相关。2、ncRAN基因的高表达与神经母细胞瘤患者的预后有着密切的关联。3、ncRAN具有原癌基因的特性的长的非编码RNA。