桑枝活性成分分离纯化及其药理作用的研究

论文摘要

生物体的内环境无时无刻不在生成自由基,自由基在生物体内很容易与蛋白质、不饱和脂肪酸反应,引发氧化修饰作用,成为机体衰老及与衰老相关疾病的主要诱因。同时,随着年龄的增长,机体的抗氧化防御能力却在逐渐减弱,与衰老相关的疾病如肿瘤、心血管疾病、糖尿病、白内障、老年性痴呆等发病机会大大增加,所以自由基与衰老相关疾病发生机制之间的关系,成为了研究的新热点。为了最大限度地降低自由基对机体的损害,人们开始寻求抗氧化剂,但人工合成的抗氧化剂具有致癌性等很大的毒副作用。植物体富含黄酮类化合物等活性成分,具有很强的抗氧化活性,是天然、安全的抗氧化剂来源物。为此,植物抗氧化剂的开发与应用,成为了人们关注的研究领域。桑枝是桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝。《中华人民共和国药典》记载桑枝具有祛风湿、利关节、行水之功效,适用于风寒湿痹、四肢拘挛、脚气浮肿之病症。临床上主要用于治疗肩臂关节及手足酸痛麻木、风湿痹痛、瘫痪等多种疾病。现代药理学研究发现,桑科桑属植物具有降血糖、降血压、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛、抑制花生四烯酸代谢等药理活性,其药理活性与其所含有活性成分密切相关。我国桑枝资源非常丰富,但对其利用主要局限于以桑枝药材原料为主的初级开发,查明桑枝药用活性成分和药理作用,对发展天然中药制剂等产品的深度开发,蕴藏有巨大的发展空间。本课题以桑枝抗氧化性为中心,采用测定、分离、纯化、鉴定等方法,对其中的活性物质进行分析,将所分离纯化的活性物质进行一系列的药理学实验,探明其活性物质的药理作用机理,从而为桑枝深度开发提供科学依据。主要研究结果如下：1、对桑枝中黄酮类化合物提取和测定条件进行优化,确立了桑枝过160目,以80%乙醇作为溶剂,超声波提取20 min,在80℃下回流30 min,重复提取3次,为桑枝黄酮类化合物提取的最佳实验方案。建立了桑枝黄酮类化合物含量测定的分光光度法,该方法精密度、稳定性、重现性和回收率均符合测试要求。2、采用正交实验法对桑枝多糖的测定条件进行优化,确立了桑枝过160目,超声提取40min,在100℃水浴中提取90 min,操重复2次,为最佳提取方案。对桑枝多糖进行了精制,得到桑枝多糖与葡萄糖对照品的换算因子为4.96。桑枝中富含多糖,其含量在桑枝品种间存在显著差异,高低相差约1.7倍；在同一品种的不同生长季节和老嫩程度间,春季新生嫩桑枝中多糖含量>冬季一年生老桑枝中多糖含量>春季老桑枝中多糖含量。3、DNJ本身没有发色基团,不能用液相色谱直接测定。本研究采用9-芴基氯甲酸甲酯标记、配有荧光检测器的反相高效液相色谱法,建立了可检测大数量桑枝样品中DNJ含量的快速、可靠方法。利用正交实验法,确立了在30℃、pH7下反应50 min为最佳衍生化条件。DNJ含量在桑品种间存在显著差异,高低相差2.9倍,在同一品种的不同生长季节和老嫩程度间,冬季桑枝中含量最高,春季老枝中含量次之,春季新生嫩枝中含量最低,表明DNJ在桑枝中具有一定的累积作用。4、采用蛋白快速分离纯化仪与示差检测器相结合的方法,分离纯化桑枝中的多糖,用液相色谱测定其分子量,用离子色谱分析其单糖组成,用红外光谱进行结构鉴定。研究结果表明,桑枝多糖是α-构形吡喃醛糖,分子量约为6.5×104,主要由鼠李糖、树胶醛糖、半乳糖、葡萄糖和木糖组成,它们的摩尔比分别为9.1：24.1：44.1：12.22：7.8。5、对桑枝多糖进行硫酸化、磷酸化、乙酰化和苯甲酸化,得到四种衍生物,研究其结构与抗氧化活性之间的关系。结果发现,衍生化后的多糖的抗氧化活性显著提高,温度和酸碱度显著影响其抗氧化活性,抗氧化活性随pH值升高而增高,随着温度升高而降低。6、根据DPPH的液相色谱特点,对桑枝乙醇提取液中的主要抗氧化活性物质进行了快速分离纯化,确定了桑枝乙醇提取液中的主要抗氧化活性物质为氧化芪三酚。此方法简单、快速、方便,避免了传统方法的反复操作和活性物质的分解。7、采用在线液相色谱法和液相色谱-电喷雾质谱联用法,鉴定桑枝中抗氧化活性成分,确立氧化芪三酚在品种间的分布规律。桑枝富含有氧化芪三酚,其含量在桑品种间存在显著差异,高低相差2.3倍。此实验结果对于推动桑枝及其制品的开发利用,具有一定的意义。8、对从桑枝中分离到的四种活性物质----氧化芪三酚、二苯乙烯苷、桑色素和芸香苷,进行抗氧化活性检验,确立它们的结构与抗氧化活性之间的关系。结果显示,氧化芪三酚分子中的4和3’位上的羟基,对于清除超氧离子、羟基自由基和DPPH具有重要作用；桑色素分子中3位上的羟基对于清除超氧离子和羟基自由基有重要的作用,芸香苷分子中的3位上的糖基对其还原力有重要的作用。9、用ICR小鼠的血清和肝脏中的生化指标、组织病理学和细胞因子表达,研究桑枝乙醇提取液对四氧嘧啶引起的肝损伤的保护作用。研究结果表明,桑枝乙醇提取液具有护肝作用,其作用机理主要有以下三点：（1）桑枝提取液作为一种抗氧化剂,直接清除四氧嘧啶产生的自由基；（2）桑枝提取液作为一种金属络合剂,通过络合金属来抑制自由基的产生,从而降低自由基的损害；（3）桑枝提取液作为糖苷酶的抑制剂,通过降低血糖浓度来抑制抗氧化活性酶的糖基化,从而提高其活性来降低损害。10、DPPH可以通过提高转氨酶活性、MDA含量和NO水平,并伴随GSH水平和SOD、CAT、GPx活性的降低,对机体肝脏产生损害,组织病理学观察和炎症因子表达的研究结果进一步证实了DPPH的此毒性。此研究结果对于建立DPPH的急性肝损伤模型,并以此模型来研究药物对氧化压力的相关疾病的治疗作用,具有积极的意义。11、利用硫代乙酰胺的肝损伤模型,研究桑枝中芸香苷的护肝作用。结果表明,桑枝中芸香苷具有明显的护肝作用,其作用机理有以下四个方面：（1）通过促进核糖体RNA的合成来促使肝细胞再生；（2）作为一种抗氧化剂来清除和调节细胞内谷胱甘肽的含量；（3）通过稳定细胞膜和调节通透性来阻止有毒物质的进入；（4）抑制星状肝细胞向纤维原细胞的转变,从而来阻止肝硬化的发生。12、利用酒精引起的肝损伤模型,调查桑枝中氧化芪三酚及其糖苷的护肝作用。结果表明,氧化芪三酚和二苯乙烯苷能够通过提高抗氧化活性酶活性和GSH的含量、降低MDA水平、削弱TNF-α表达以及改善小鼠肝组织状况等,对酒精引起的肝损伤起保护作用；氧化芪三酚的护肝作用显著高于二苯乙烯苷的护肝作用,这两种活性物质的护肝作用与抗氧化活性密切相关。13、通过桑枝提取液组分中抗炎活性的筛选,从抗炎活性最强的组分中分离到氧化芪三酚和二苯乙烯苷两种活性物质。采用醋酸引起的扭体实验、福尔马林引起的舔足实验、皮肤毛细管通透性实验、角叉胶引起足跖肿胀实验以及局部PGE2含量,检验桑枝中的这两种活性物质的抗炎、镇痛活性,结果二苯乙烯苷表现出很强的抗炎、镇痛活性,此物质可能是桑枝中起抗炎镇痛作用的主要物质之一。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 主要缩写词
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 自由基研究概述
• 1. 自由基的概念
• 2. 自由基的性质
• 3. 自由基的种类
• 3.1 超氧阴离子自由基
• 3.2 羟基自由基
• 3.3 NO自由基
• 3.4 过氧化氢和单线态氧
• 4. 机体内的自由基清除系统
• 4.1 SOD
• x'>4.2 CAT和GP_x
• 4.3 小分子氧自由基清除剂
• 4.4 其它的抗氧化剂
• 第2章 植物化学成分研究概述
• 1. 化学成分的提取
• 2. 化学成分的分离
• 2.1 根据溶解度的差别进行分离
• 2.2 根据物质在两种溶剂中的不同分配比进行分离
• 2.3 根据物质的吸附性差别进行分离
• 2.4 根据物质分子大小进行分离
• 2.5 根据物质解离程度不同进行分离
• 2.6 化学成分提取分离新技术
• 3. 化学成分的结构鉴定
• 3.1 紫外光谱
• 3.2 外光谱
• 3.3 核磁共振谱
• 3.4 质谱
• 3.5 旋光光谱
• 4. 化学成分的合成
• 4.1 生物合成
• 4.2 细胞培养生物天然化合物
• 第3章 植物活性物质药理作用研究概述
• 1. 黄酮类化合物
• 1.1 抗癌作用
• 1.2 对肾脏疾病的作用
• 1.3 促进动物生长
• 1.4 提高机体免疫力
• 1.5 促进生殖系统发育,提高繁殖力
• 1.6 对心血管的保护作用
• 1.7 抗辐射作用
• 1.8 抗炎作用
• 1.9 类黄酮化合物的解热作用
• 1.10 黄酮类化合物的镇痛作用
• 1.11 防治糖尿病及其并发症
• 1.12 护肝作用
• 2. 多糖类化合物的药理作用
• 2.1 降血糖作用
• 2.2 调节免疫功能
• 2.3 抗辐射作用
• 2.4 抗氧化防衰老的作用
• 2.5 保护作用
• 2.6 其它作用
• 3. 1-脱氧野尻霉素
• 3.1 DNJ的降血糖作用
• 3.2 DNJ抑制肿瘤转移的作用
• 3.3 DNJ对病毒活性的抑制作用
• 第4章 桑枝化学成分及其药理作用研究
• 1. 桑枝的主要化学成分
• 2. 桑枝的药理作用
• 2.1 抗炎作用
• 2.2 免疫作用
• 2.3 降血脂的作用
• 2.4 降血糖作用
• 第二篇 桑枝中生物活性物质检测的方法学研究
• 第5章 桑枝中黄酮类化合物检测的方法学研究
• 1. 试验材料
• 1.1 桑枝
• 1.2 试剂及标准品
• 1.3 仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 试液的制备
• 2.2 含量测定
• 2.3 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 黄酮类化合物测定的线性关系
• 3.2 桑枝黄酮类化合物的提取条件
• 3.3 桑枝黄酮类化合物测定方法的评价
• 4. 讨论
• 第6章 桑枝多糖含量的测定
• 1. 试验材料
• 1.1 仪器与试药
• 1.2 桑枝
• 2. 试验方法
• 2.1 对照品溶液的制备
• 2.2 样品溶液的配制
• 2.3 蒽酮-硫酸试液的配制
• 2.4 桑枝多糖的提取与精制
• 2.5 最大吸收波长的选择
• 2.6 多糖含量的测定
• 2.7 桑枝多糖换算因子的计算
• 2.8 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝多糖测定的线性关系考察
• 3.2 桑枝多糖的换算因子
• 3.3 最佳实验条件的确立
• 3.4 重现性实验
• 3.5 稳定性实验
• 3.6 加样回收率实验
• 3.7 不同品种桑枝中多糖含量的差异
• 3.8 同一品种不同时期和老嫩桑枝中多糖含量的差异
• 4. 讨论
• 第7章 桑枝中DNJ含量的测定
• 1. 试验材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 桑枝
• 2. 试验方法
• 2.1 色谱条件
• 2.2 标样液的配制
• 2.3 供试品液的制备
• 2.4 样品中DNJ的衍生化
• 2.5 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝中DNJ的定性鉴定
• 3.2 标准曲线的绘制
• 3.3 DNJ衍生化条件的选择
• 3.4 DNJ最佳提取条件的确立
• 3.5 稳定性试验
• 3.6 精密度试验
• 3.7 重现性试验
• 3.8 加样回收率
• 3.9 不同品种桑枝中DNJ含量的差异
• 3.10 同一品种不同时期和老嫩程度的桑枝中DNJ含量的差异
• 4. 讨论
• 第三篇 桑枝多糖分离纯化、衍生化及活性的研究
• 第8章 桑枝多糖分离纯化及结构鉴定的研究
• 1.试验材料
• 1.1 桑枝
• 1.2 仪器
• 1.3 试剂
• 2. 试验方法
• 2.1 桑枝多糖的提取
• 2.2 桑枝多糖的纯化
• 2.3 组分Ⅱ的分子量测定
• 2.4 外光谱检测
• 2.5 用离子色谱来进行多糖的单糖组成分析
• 2.6 IC分析单糖和糖醛酸的条件
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝多糖的分离纯化及分子量
• 3.2 桑枝多糖的红外光谱分析
• 3.3 桑枝多糖的离子色谱分析
• 4. 讨论
• 第9章 桑枝多糖衍生物的抗氧化活性的研究
• 1. 试验材料
• 1.1 桑枝多糖及其衍生物
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 各样品的抗超氧离子活性测定
• 2.2 各样品的清除羟基自由基的活性测定
• 2.3 各种样品的抗DPPH活性测定
• 2.4 铁离子络合作用测定
• 2.5 还原力测定
• 2.6 温度和pH影响样品抗氧化活性的测定
• 2.7 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝多糖及其衍生物的抗超氧离子能力
• 3.2 桑枝多糖及其衍生物的抗羟基自由基活性
• 3.3 桑枝多糖及其衍生物清除DPPH自由基的作用
• 3.4 桑枝多糖及其衍生物的还原力
• 3.5 桑枝多糖及其衍生物的金属络合能力
• 3.6 温度和pH对桑枝多糖及其衍生物的抗氧化活性的影响
• 4. 讨论
• 第四篇 桑枝中主要抗氧化活性物质分离纯化和体外实验研究
• 第10章 桑枝中酚类化合物的含量及其抗氧化活性的研究
• 1. 试验材料
• 1.1 桑枝
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 桑枝提取物的制备
• 2.2 桑枝不同提取物的抗氧化活性测定
• 2.3 酚类化合物含量的测定
• 2.4 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝中总酚类化合物的含量
• 3.2 TBA方法测定的桑枝提取液抗氧化作用
• 3.3 DPPH方法测定的桑枝提取液抗氧化作用
• 4. 讨论
• 第11章 桑枝乙醇提取液的抗氧化活性和主要抗氧化活性物质的分离纯化
• 1. 试验材料
• 1.1 桑枝
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2. 试验方法
• 2.1 桑枝乙醇提取液的制备
• 2.2 用自由基在线法确定桑枝提取液中的最强抗氧化活性成分
• 2.3 主要抗氧化活性物质的鉴定
• 2.4 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝提取液各组分的总酚含量
• 3.2 桑枝乙醇提取液各组分的超氧离子清除能力
• 3.3 桑枝提取组分的羟基自由基清除能力
• 3.4 桑枝乙醇提取液中各组分的DPPH自由基清除能力
• 3.5 桑枝乙醇提取液各组分的铁离子络合力
• 3.6 桑枝乙醇提取液各组分的还原力
• 3.7 桑枝乙醇提取液中抗氧化活性成分的分离
• 3.8 活性成分的鉴定
• 3.9 桑枝乙醇提取液和氧化芪三酚的抗氧化活性
• 4. 讨论
• 第12章 在线液相色谱法和液相色谱-电喷雾质谱联用法测定桑枝中抗氧化活性成分
• 1. 试验材料
• 1.1 仪器与试药
• 1.2 色谱质谱条件
• 2. 试验方法
• 18柱的预处理'>2.1 Sep-Pak C₁₈柱的预处理
• 2.2 样品的处理
• 2.3 标准溶液的配制
• 2.4 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝乙醇提取液中主要抗氧化活性物质的鉴定
• 3.2 标准曲线
• 3.3 方法的重现性、稳定性、精密度和回收率
• 3.4 HPLC测定不同品种桑枝中氧化芪三酚的含量
• 4. 讨论
• 第13章 桑枝中活性物质结构与抗氧化活性的关系的研究
• 1. 试验材料
• 1.1 桑枝
• 1.2 仪器
• 1.3 试剂
• 2. 试验方法
• 2.1 桑枝中主要活性物质的分离纯化和鉴定
• 2.2 抗超氧离子活性测定
• 2.3 清除羟基自由基活性测定
• 2.4 抗DPPH活性测定
• 2.5 还原力测定
• 2.6 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 桑枝四个化合物的超氧离子清除能力
• 3.2 桑枝四个化合物的羟基自由基清除能力
• 3.3 桑枝四个化合物的DPPH自由基清除能力
• 3.4 桑枝四个化合物的还原力
• 4. 讨论
• 第五篇 药理实验部分
• 第14章 桑枝乙醇提取液对小鼠抗氧化能力的影响
• 1. 试验材料
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验动物
• 2. 试验方法
• 2.1 桑枝乙醇提取液的制备
• 2.2 动物分组和处理
• 2.3 血清和肝脏中生化指标的测定
• 2.4 肝组织切片制备和显微观察
• 2.5 RT-PCR
• 2.6 统计分析
• 3. 结果和讨论
• 第15章 DPPH对ICR小鼠急性肝损伤的研究
• 1. 试验材料
• 1.1 实验药品
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2. 试验方法
• 2.1 动物处理和实验设计
• 2.2 血清转氨酶活性测定
• 2.3 肝脏脂过氧化反应测定
• 2.4 CAT活性测定
• 2.5 GSH含量的测定
• 2.6 NO浓度测定
• x和SOD的活性的测定'>2.7 GP_x和SOD的活性的测定
• 2.8 蛋白含量
• 2.9 组织病理学研究
• 2.10 RT-PCR测定各处理组小鼠的炎症因子mRNA水平
• 2.11 统计分析
• 3. 结果与分析
• 4. 讨论
• 第16章 桑枝芸香苷对硫代乙酰胺引起的小鼠急性肝损伤的保护作用
• 1. 试验材料
• 1.1 药品
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2. 试验方法
• 2.1 动物分组和处理
• 2.2 血清转氨酶活性测定
• 2.3 肝脏脂过氧化反应测定
• 2.4 CAT活性测定
• 2.5 GSH含量的测定
• 2.6 NO浓度测定
• 2.7 蛋白含量测定
• 2.8 组织病理学研究
• 2.9 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶的活性
• 3.2 肝组织中的脂过氧化反应
• 3.3 肝组织中的SOD活性
• 3.4 肝组织中的过氧化氢酶活性
• 3.5 谷胱甘肽转移酶的活性
• 3.6 谷胱甘肽氧化酶的活性
• 3.7 谷胱甘肽还原酶的活性
• 3.8 肝脏中还原型谷胱甘肽的含量
• 3.9 肝组织中的NO含量
• 3.10 肝组织的病理学研究
• 4. 讨论
• 第17章 氧化芪三酚和二苯乙烯苷对酒精引起的肝损伤的保护作用
• 1. 试验材料
• 1.1 实验药品
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2. 试验方法
• 2.1 氧化芪三酚和二苯乙烯苷的分离纯化
• 2.2 实验设计
• 2.3 肝脏脂过氧化反应测定
• 2.4 CAT活性测定
• 2.5 GSH含量的测定
• 2.6 蛋白含量测定
• 2.7 组织病理学研究
• 2.8 RT-PCR来测定各处理的小鼠的mRNA水平
• 2.9 统计分析
• 3. 结果与分析
• 4. 讨论
• 第18章 氧化芪三酚和二苯乙烯苷抗炎镇痛作用的研究
• 1. 试验材料
• 1.1 实验药品
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2. 试验方法
• 2.1 镇痛实验
• 2.2 福尔马林引起的小鼠舔足实验
• 2.3 小鼠角叉胶引起的足跖肿胀实验
• 2.4 小鼠毛细血管通透性实验
• 2含量测定'>2.5 小鼠局部炎症组织PGE₂含量测定
• 2.6 统计分析
• 3. 结果与分析
• 4. 讨论
• 参考文献
• 创新点
• 作者简历
• 在学期间发表的论文