论文摘要
目的:血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）完整性的破坏已成为实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）和人类多发性硬化（multiplesclerosis,MS）发病机制中的重要环节。本实验应用硫辛酸（lipoic acid,LA）治疗Wistar大鼠EAE,观察BBB的功能变化及细胞间粘附分子-1（intercellular adhension molecule-1,ICAM-1）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）表达的变化,研究ICAM-1、TNF-α与BBB的相互关系及其在EAE中的作用。探讨EAE的发病机制和应用LA治疗EAE的作用机制,为EAE和MS的免疫病理机制提供新的理论支持,也为今后临床应用硫辛酸辅助治疗MS等CNS自身免疫性疾病提供实验依据。方法:制备EAE动物模型,随机分为EAE组、LA治疗组和佐剂组。LA治疗组从免疫后（post-inoculation,p.i.）0～5天每日腹腔注射LA（100mg/kg）一次。观察各组在不同时间点血清和脑脊液中白蛋白含量比值（CSF to serum albumin quotient,QA）,通过QA评定BBB的损害。按照国际通用的五分法评估临床症状,观察体重变化、发病率等临床指标。在p.i.6、8、10、12、14、16天处死动物,取脑和脊髓用免疫组化技术检测CNS中不同部位ICAM-1和TNF-α的表达,并对EAE组ICAM-1和TNF-α进行相关分析。结果:1.EAE组、LA治疗组于p.i.8d前无任何症状,临床症状评分为0,在p.i.8-11d开始出现轻度异常,主要表现为活动减少、食欲减低、皮毛松、毛色差、体重轻度下降,但尚未出现尾麻痹,临床症状评分为0,在p.i.12天开始出现明显的临床症状,起病突然,发病轻重不一,表现有尾麻痹、后肢无力、体重下降等。在p.i.14天达高峰,表现为后肢瘫痪、易激惹、体重迅速下降,个别处于濒死状态。在p.i.16天左右病情开始缓解,临床症状减轻,体重开始回升,相应的临床症状评分、发病率下降。EAE组发病率73%,LA治疗组20%,较EAE组降低（X2=8.57,P＜0.01）;EAE组平均体重减轻15.06±4.20g,LA治疗组减轻7.07±3.75g,较EAE组减少（t=5.54,P＜0.01）;EAE组平均高峰期评分2.07±1.67分,LA治疗组0.60±1.12分,较EAE组降低（t=3.259,P＜0.01）;EAE组平均病灶数15.20±2.11个,LA治疗组6.93±3.20个,较EAE组减少（t=8.36,P＜0.01）;EAE组平均起始发病时间13.73±1.22天,LA治疗组15.07±0.96天,较EAE组延迟（t=3.32,P＜0.01）。这5项临床指标比较,LA治疗组与EAE组均有统计学差异。佐剂组未见发病,体重呈增长趋势。2.EAE组、LA治疗组和佐剂组QA值均出现先升高后下降的变化趋势。EAE组QA值在p.i.6天已经有增高（0.19±0.01）,在p.i.8天时,QA值达到最大值（0.31±0.07）,表明此时BBB的破坏达到高峰,但此时动物尚未出现明显的临床症状,提示BBB的破坏早于临床症状的发生。后QA值下降,BBB功能逐渐恢复。LA治疗组在p.i.6～12天QA值呈缓慢增高趋势,p.i.14天达高峰（0.20±0.04）,但QA值增幅较EAE组小且出现峰值的时间较EAE组延迟,表明LA治疗后BBB受损较轻。佐剂组QA值在免疫后初期（p.i.8d）虽然也出现增高（0.13±0.03）,但升高幅度明显低于EAE组。经两因素多水平方差分析统计表明:在p.i.6～16天,EAE组与LA治疗组比较QA值总的变化趋势有统计学差异（F=16.51,P＜0.01）;EAE组与佐剂组比较QA值总的变化趋势有统计学差异（F=17.10,P＜0.01）。3.ICAM-1在EAE组、LA治疗组和佐剂组的血管内皮细胞中均有表达,且表达程度与病情轻重相一致。当其表达增加时,表现为在扁平的血管内皮细胞周围着色加深。经图像分析显示,EAE组ICAM-1阳性染色平均灰度值在p.i.14天时达到最小值（130.73±16.27）,此时LA治疗组也有所下降（153.10±16.22）,但下降较缓慢,与EAE组比较有统计学差异（P＜0.01）。经两因素多水平方差分析统计表明:在p.i.10～16天,EAE组与LA治疗组ICAM-1阳性染色平均灰度值比较有统计学差异（P＜0.01）,表明LA治疗组ICAM-1表达明显低于EAE组;在p.i.10～16天,EAE组与佐剂组ICAM-1阳性染色平均灰度值比较有统计学差异（P＜0.01）,表明EAE组ICAM-1的表达明显高于佐剂组。4.TNF-α主要由活化的单核—巨噬细胞、T细胞、NK和肥大细胞产生,免疫组化染色阳性表达表现为血管渗出的淋巴细胞周围有不同程度着色,且表达程度与病情轻重相一致。经图像分析显示,EAE组TNF-α阳性染色平均灰度值在p.i.14天时达到最小值114.99±19.29,此时LA治疗组也有所下降（137.57±17.63）,但下降较缓慢,与EAE组比较具有统计学差异（P＜0.01）。经两因素多水平方差分析统计表明:在p.i.10～16天,EAE组与LA治疗组TNF-α阳性染色平均灰度值比较有统计学差异（P＜0.01）,表明LA治疗组TNF-α表达明显低于EAE组;在p.i.10～16天,EAE组与佐剂组TNF-α阳性染色平均灰度值比较有统计学差异（P＜0.01）,表明EAE组TNF-α的表达明显高于佐剂组。相关统计分析显示:在p.i.6～p.i.16天,EAE组ICAM-1与TNF-a的阳性表达具有显著正相关性（r=0.82,P＜0.01）结论:1.BBB损伤先于EAE临床症状出现之前。2.EAE不同时期EC表面ICAM-1及CNS内TNF-α的表达与临床症状的严重程度相一致。3.TNF-α与ICAM-1的表达具有正相关性。4.LA通过下调ICAM-1和TNF-α的表达,恢复BBB的正常功能,从而有效抑制EAE。
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