毒死蜱降解菌的分离鉴定、降解特性研究及有机磷水解酶基因的克隆

论文摘要

有机磷杀虫剂毒死蜱由于其活性高,作用谱广,在许多国家广泛应用于粮食蔬菜和水果病虫害的防治,造成了严重的残留问题。毒死蜱在土壤中残留期较长,会对水生生物及人类等带来极大的危害,造成经济损失并影响生态环境。研究表明毒死蜱在环境中的消失主要是由于微生物的降解所致,因此,开发毒死蜱污染土壤的微生物修复技术,有利于保护生态环境和人类健康。本研究从某化工厂污水处理池的活性污泥中分离筛选到一株能高效降解毒死蜱的菌株D-8,经形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因相似性比较,将其鉴定为鞘氨醇盒菌属（Sphingopyxis sp.）。菌株D-8在pH 6.0-9.0的范围内生长良好,最适pH值为7.0；最适生长温度为30℃；葡萄糖为其最适生长碳源,蛋白胨为其最适生长氮源；该菌株可以在以毒死蜱为唯一碳源的培养基中生长,通气量越大,菌株生长情况越好。在温度30℃和接种量1%条件下,菌株D-8可在1 h内将基础盐培养基中50 mg/L毒死蜱完全降解。菌株D-8对毒死蜱降解的最适温度为30℃,最适pH值为7.0。菌株D-8对5～400 mg/L的毒死蜱均有较好的降解效果；金属离子Zn2+、Mn2+和Mg2+（0.1 mmol/L）对菌株D-8降解毒死蜱无显著影响,而Ni2+、Hg2+、Co2+等金属离子（0.1 mmol/L）会抑制菌株D-8对毒死蜱的降解。D-8除了能降解毒死蜱以外还能降解甲基对硫磷、杀螟硫磷、丙溴磷、辛硫磷等有机磷农药。根据已报道的有机磷水解酶基因（mpd）设计引物,能从菌株D-8扩增到长度为996 bp的mpd基因。通过序列相似性比对,该基因与Stenotrophomonas sp. Dsp-4中的mpd（GenBank accession No. DQ356951）同源性高达99%,与Plesiomonas sp. M6中的mpd （GenBank accession No. AF338729）同源性也高达98%。将扩增到的mpd基因构建到表达载体pET29a中,通过E.coli BL21（DE3）进行表达,产物具有有机磷水解酶活性,能使毒死蜱中硫磷键断裂。通过染色体步移（chromosome walking）,获得了mpd基因上游和下游片段,它们和mpd基因拼接后的总长为4617 bp。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 1 有机磷类农药及毒死蜱简介
• 1.1 有机磷类农药简介
• 1.2 毒死蜱简介
• 2 有机磷类农药及毒死蜱在环境中的降解
• 2.1 有机磷类农药在环境中的降解
• 2.2 毒死蜱在环境中的降解
• 3 国内外毒死蜱生物降解的研究进展
• 4 有机磷降解酶基因与功能
• 5 微生物降解有机磷农药的展望
• 参考文献
• 实验部分
• 第一章 毒死蜱降解菌株D-8的分离、鉴定及生长特性研究
• 第一节 毒死蜱降解菌株D-8的分离和鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试土样、菌株、试剂及仪器
• 1.1.1 供试土样
• 1.1.2 供试农药及试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 仪器
• 1.2 降解菌株的富集和分离
• 1.3 降解菌株的培养特性及生理生化鉴定
• 1.4 毒死蜱降解菌株16S rRNA基因序列的PCR扩增及测序
• 1.4.1 菌株基因组总DNA的提取
• 1.4.2 降解菌株16S rRNA基因的PCR扩增
• 1.4.3 PCR产物的T/A克隆
• 1.4.4 普通感受态细胞的制备和转化
• 1.4.5 质粒DNA的小量提取
• 1.4.6 16S rRNA基因的序列测定
• 1.4.7 降解菌株的系统发育分析
• 1.5 毒死蜱的检测方法
• 1.5.1 紫外扫描分析法
• 1.5.2 高效液相色谱分析法
• 2 结果与分析
• 2.1 毒死蜱降解菌株的分离
• 2.2 毒死蜱降解菌株D-8的菌落形态和生理生化特征
• 2.3 菌株D-8的基因组DNA的提取
• 2.4 菌株D-8的系统发育地位
• 第二节 毒死蜱降解菌株D-8的生长特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、试剂与培养基
• 1.2 菌体生长量的测定
• 1.3 不同环境条件对菌株D-8生长的影响
• 1.3.1 培养温度对菌株D-8生长的影响
• 1.3.2 初始pH值对菌株D-8生长的影响
• 1.3.3 不同碳源对菌株D-8生长的影响
• 1.3.4 不同氮源对菌株D-8生长的影响
• 1.3.5 通气量对菌株D-8生长的影响
• 1.3.6 NaCl浓度对菌株D-8生长情况的影响
• 1.3.7 菌株对抗生素的耐受性
• 2 结果与分析
• 2.1 温度对菌株D-8生长的影响
• 2.2 初始pH对菌株D-8生长的影响
• 2.3 不同碳源对菌株D-8生长的影响
• 2.4 不同氮源对菌株D-8生长的影响
• 2.5 通气量对菌株D-8生长的影响
• 2.6 NaCl浓度对菌株D-8生长情况的影响
• 2.7 菌株对抗生素的耐受性
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第二章 菌株D-8对毒死蜱降解特性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂、菌株
• 1.1.1 培养基与试剂
• 1.1.2 菌株
• 1.2 菌种的制备
• 1.3 毒死蜱的提取及检测方法
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株D-8对毒死蜱降解曲线的绘制
• 2.2 温度对菌株D-8降解毒死蜱的影响
• 2.3 培养基初始pH值对菌株D-8降解毒死蜱的影响
• 2.4 毒死蜱初始浓度对菌株D-8降解毒死蜱的影响
• 2.5 接种量对菌株D-8降解毒死蜱的影响
• 2.6 金属离子对菌株D-8降解毒死蜱的影响
• 2.7 菌株D-8对不同有机磷农药的降解情况
• 3 本章小结
• 第三章 有机磷水解酶基因（mpd）的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂、供试菌株
• 1.1.1 培养基与试剂
• 1.1.2 供试菌株和质粒
• 1.2 菌体基因组DNA的提取
• 1.3 质粒DNA的小量提取
• 1.4 感受态细胞的制备
• 1.5 有机磷水解酶基因的PCR扩增
• 1.6 酶连及酶连产物的转化
• 1.7 序列测定与分析
• 1.8 有机磷水解酶基因表达载体的构建与酶活力分析
• 1.8.1 表达载体的构建
• 1.8.2 酶活力分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR法克隆有机磷水解酶基因
• 2.2 序列测定与比较分析
• 2.3 mpd基因的表达和酶活力分析
• 2.3.1 重组表达载体的构建
• 2.3.2 粗酶酶活检测
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 有机磷水解酶基因（mpd）的侧翼序列扩增及分析
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂、供试菌株
• 1.1.1 培养基与试剂
• 1.1.2 供试菌株和质粒
• 1.2 菌株基因组DNA与质粒DNA的提取
• 1.3 侧翼序列SEFA-PCR引物设计和扩增
• 1.4 酶连及酶连产物的转化
• 1.5 序列测定与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 mpd结构基因上游序列的扩增及分析
• 2.2 mpd结构基因下游序列的扩增及分析
• 3 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 本论文的创新点及不足之处
• 附录一 文中所用试剂配方
• 附录二 相关DNA序列
• 攻读硕士学位期间发表或已接受的学术论文
• 致谢