缺氧诱导因子1α（HIF-1α）反义寡核苷酸对喉鳞癌荷瘤裸鼠模型化疗（顺铂）增敏作用的实验研究

论文摘要

目的:确立应用缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）反义寡核苷酸联合化疗（顺铂）杀伤活体动物模型体内喉鳞状细胞癌的各种条件和方法,为喉鳞癌基因治疗的临床前期研究提供动物实验依据。方法:1、喉鳞癌裸鼠模型的建立选择Balb/c纯系裸鼠70只,鼠龄3-4周龄,体重12-18g,均为雌性,于背部皮下注入2×106Hep-2细胞0.2ml,对照组注射PBS0.2ml。隔离室净化空气层流架中,恒温恒湿,灭菌处理的饲料和水,供自由食用。当肿瘤长至8-10mm时,用于实验。2、观察不同化疗剂量对荷瘤裸鼠的治疗作用:将肿瘤长至8-10mm的裸鼠25只随机分为五组,每组5只,Ⅰ组1mg/kg,Ⅱ组2mg/kg,Ⅲ组3mg/kg,Ⅳ组4mg/kg,对照组为等量生理盐水,采用腹腔注射,隔日1次。注射5次后杀鼠荷瘤取出后称重观察抑瘤情况;部分放入70%的酒精中固定,应用流式细胞技术检测细胞凋亡情况。3、在较适化疗剂量下应用HIF-1α反义寡核苷酸对肿瘤的抑制作用:将肿瘤长至10mm的裸鼠选择成瘤较好的20只随机分为四组:A组（正义+化疗）,B组（反义+化疗）,C组（化疗）,D组（空白对照）,每次注射反义寡核苷酸100μg/只（按脂质体:AS-ODN=1:1进行包裹加入等量的细胞培养液,）,0.2ml向肿瘤基底部3点以及中央1点注射,隔日注射一次,共8次,前5次注射24小时后,给予荷瘤裸鼠顺铂3mg/kg腹腔注射,每2天测量一次鼠重、瘤体最大长径及最大垂直径,在最后一次注射反义寡核苷酸24小时后将实验鼠脱颈处死,应用流式细胞仪、免疫组化、电镜观察肿瘤的抑瘤、凋亡情况及相关蛋白表达。结果:1、注入2×106Hep-2细胞0.2ml后,48h开始长瘤,近3周长至10mm大小。实验组60只裸鼠,成瘤率95%,杀鼠做病理示鳞状细胞癌,分化三级。2、采用不同剂量的化疗药物进行化疗时,随着化疗药物剂量的增加,肿瘤细胞的抑瘤率和凋亡率逐渐增加。化疗药物剂量为3mg/kg时,作用明显而动物的全身反应不明显,所以本实验选用3mg/kg为最适化疗剂量。3、化疗联合应用HIF-1α反义寡核苷酸对肿瘤的抑制作用观察结果瘤重的变化及抑瘤率:反义组瘤重最小,抑瘤率为（56.83±4.57）明显高于空白对照、化疗对照以及正义+化疗对照3组（p<0.01）;凋亡率及细胞周期:反义组凋亡率最大（44.750±5.710）明显高于空白对照、化疗对照以及正义对照3组（p<0.01）。反义组细胞G0/G1期比例明显低于其它3组,其它3组细胞阻滞在G0/G1期,S期和G2/M期细胞减少;免疫组化SP法染色显示:HIF-a、P53及VEGF在反义治疗组表达较其它3组明显较少;流式细胞仪检测结果显示反义治疗组的HIF-1α、P53、VEGF蛋白表FI值（0.905±0.141,0.773±0.128,0.848±0.068）明显低于化疗对照以及正义对照组（p<0.01）。与免疫组化结果相符;超微结构观察:电镜下反义+化疗组可见凋亡细胞,细胞核染色质浓缩电子密度增加,边集于核膜下,形成新月状称为半月,部分细胞膜亦可见球形膨出,线粒体体积增大,全部嵴和部分膜融合或消失,粗面内质网扩张,腔内充满分泌物,有脱颗粒现象。空白对照组可见细胞呈椭圆形,细胞质丰富,核椭圆形略不整形,常染色质丰富,异染色质少,有大而明显的核仁。结论:通过对活体裸鼠喉癌荷瘤模型,腹腔注射不同剂量化疗药物（顺铂）,各治疗组均有抑瘤效果,但3mg/kg抑瘤效果明显且动物全身反应不明显,故3mg/kg为最适化疗剂量;对活体裸鼠喉癌荷瘤模型,应用化疗联合转染缺氧诱导因子（HIF-1α）反义寡核苷酸,综合大体标本、流式细胞术、免疫组化、电镜结果分析:各治疗组（反义+化疗组;正义+化疗组;单纯化疗组;空白对照组）均有抑瘤效果,其中反义+化疗组效果较其他组明显,这种作用可能是通过调节P53和VEGF蛋白表达来实现的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 缺氧诱导因子1α（HIF-1α）反义寡核苷酸对喉鳞癌荷瘤裸鼠模型化疗（顺铂）增敏作用的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 缺氧诱导因子（HIF-1）与肿瘤化疗耐药
• 致谢
• 个人简历