论文摘要
在本实验室前期肉仔鸡锌营养研究成果的基础上,本论文研究共设五个试验,采用原位结扎灌注肠段法和自然饲喂法研究不同络合强度有机锌及其与无机锌在肉仔鸡小肠中吸收特点的差异,并进一步探讨其具体吸收机理。试验一采用原位结扎灌注肠段法研究无机锌在肉仔鸡小肠中的吸收特点及其机理,共包括二个试验。试验1以硫酸锌为添加锌源,根据锌的吸收百分率与灌注时间的曲线关系,在二者的线性范围内确定肠段最佳灌注时间,为以后的试验在最敏感状态下研究锌吸收提供试验依据,并初步确定锌在肉仔鸡小肠中的主要吸收部位;试验2通过对锌吸收动力学特点的研究及对肉仔鸡不同肠段中MT、ZnT1、ZnT2和ZnT5基因表达的检测进一步阐明锌在肉仔鸡小肠各段中的吸收机理。试验1采用单因子完全随机试验设计,设灌注时间分别为5、15、30、45及60 min共5个处理组;试验2也采用单因子安排的完全随机设计,灌注液中以硫酸锌形式添加如下七个锌水平:0μg/ml（0 mM）、5μg/ml（0.077 mM）、10μg/ml（0.154 mM）、20μg/ml（0.308 mM）、40μg/ml（0.616 mM）、80μg/ml（1.232 mM）和160μg/ml（2.464 mM）,共7个处理。结果表明:1)肉仔鸡结扎十二指肠、空肠及回肠的锌吸收随时间变化的曲线分别符合二次曲线、二次曲线及渐近线变化。在30min以下三个肠段的锌吸收均呈线性增加,因此30min为结扎肠段的适宜灌注时间。2)在5μg/ml和10μg/ml锌添加水平下,回肠的锌吸收显著高于十二指肠（P<0.0001）,高于空肠（P=0.1252）;在其余锌添加水平下,回肠的锌吸收均显著高于十二指肠和空肠（P<0.0001）,约为十二指肠的1-2倍,空肠的1-5倍。由此可以看出,回肠是肉仔鸡锌吸收的主要部位。3)对三个肠段锌吸收速率随锌添加水平增加而变化的趋势进行动力学曲线拟合可知,回肠的锌吸收不同于十二指肠和空肠,以非饱和扩散过程为主,其P为5.72×10-3±1.1×10-4 cm2/min;而十二指肠和空肠的锌吸收则以饱和载体调节为主,其Jmax分别为5.32±1.46、2.57±0.39 nmol/min/cm, Km分别为1.44±0.33、0.51±0.17 mM。4)添加40μg/ml锌组十二指肠的MT、ZnT1mRNA表达量显著高于空肠和回肠（P≤0.0344）,空肠和回肠之间表达量相近（P≥0.1257）,而三个肠段ZnT5mRNA表达量间无明显差异（P≥0.5398）。另外,回肠MT、ZnT1和ZnT5表达量在三个肠段中均趋于最低。水平间比较的结果表明,补锌后显著提高十二指肠、空肠和回肠MTmRNA表达量（P<0.05）,显著降低回肠ZnT5mRNA表达量（P=0.034）;其它肠段的其它基因在补锌前后表达量未见显著变化（P≥0.1252）,但是添加锌后十二指肠和回肠的ZnT1、ZnT2及十二指肠ZnT5mRNA表达量有降低的趋势,而空肠的三个基因表达量却略有增加。不同锌水平间及不同肠段间ZnT2 mRNA表达量均无明显变化（P≥0.1232）。锌转运蛋白的基因表达差异进一步说明回肠锌吸收以扩散为主,而十二指肠和空肠的锌吸收与多种锌转运蛋白密切相关。试验二采用原位结扎灌注肠段法研究不同形态锌在肉仔鸡小肠中的吸收特点。采用单因子安排的完全随机设计,共设8个处理组,分别为:硫酸锌、甘氨酸锌螯合物、蛋氨酸锌螯合物、弱络合强度（Qf 6.48 ）的复合氨基酸锌（ZnAAC）、中等络合强度（Qf 30.73）的锌蛋白盐B（ZnProB）和偏极强络合强度（Qf 944.02）的锌蛋白盐A（ZnProA）、硫酸锌与甘氨酸混合物及硫酸锌与蛋氨酸混合物的处理组。结果表明:1)无论是有机锌还是无机锌,其在回肠的锌吸收均显著高于十二指肠和空肠（P<0.0001）,为后二者的1-3倍,进一步证明回肠是肉仔鸡小肠锌吸收的主要部位。2)在三个肠段中,硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组锌吸收不仅没有高于硫酸锌组,反而有降低的趋势,除空肠中硫酸锌与甘氨酸混合物组锌吸收显著低于硫酸锌组外（P=0.0779）,其余肠段中三组间差异不显著（P>0.3140）。在十二指肠中,甘氨酸锌组、蛋氨酸锌组、弱络合强度ZnAAC组、中等络合强度ZnProB组及偏极强络合强度ZnProA组中锌的吸收比硫酸锌组、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组高44.94%-102.33%（P<0.02）,吸收由低到高顺序为:硫酸锌与甘氨酸混合物组<硫酸锌与蛋氨酸混合物组<硫酸锌<蛋氨酸锌组<甘氨酸锌组<ZnAAC组< ZnProB组<ZnProA组;在空肠中,甘氨酸锌组、蛋氨酸锌组、弱络合强度ZnAAC组、中等络合强度ZnProB组及偏极强络合强度ZnProA组中锌的吸收比硫酸锌组、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组高29.35%-128.57% （P<0.04）,吸收高低顺序为硫酸锌与甘氨酸混合物组<硫酸锌与蛋氨酸混合物组<硫酸锌<蛋氨酸锌组< ZnAAC组< ZnProB组<甘氨酸锌组<ZnProA组;在回肠中,甘氨酸螯合锌组及蛋氨酸螯合锌组锌吸收率比硫酸锌组（P≥0.1872）、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组（P≤0.0572）提高了9.13%-17.01%。弱、中、偏极强络合强度有机锌组、甘氨酸螯合锌组及蛋氨酸螯合锌组五个处理组间差异不显著（P≥0.2713）,偏极强络合强度ZnProA组锌吸收率显著高于硫酸锌组、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组（P≤0.0906）;中等络合强度ZnProB组高于硫酸锌组（P=0.2656）,显著高于硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组（P≤0.0869）;而弱络合强度ZnAAC组高于硫酸锌组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组（P≥0.2130）,显著高于硫酸锌与甘氨酸混合物组（P=0.0784）。以上结果表明,有机锌与无机锌在回肠的吸收差异不显著,而在十二指肠和空肠中差异显著;螯合的有机锌在肉仔鸡小肠中的吸收率比无机形态锌的高,且有机锌的络合强度与其在肉仔鸡小肠内的吸收有密切相关性,其中偏极强络合强度有机锌的吸收最好,中等络合强度有机锌的次之,弱络合强度有机锌的最差;将蛋氨酸及甘氨酸与硫酸锌简单地混合,不能改善锌的吸收,进一步说明配体是促进还是抑制元素吸收,与配体与元素的络合（螯合）程度密切相关。试验三在试验二基础上,筛选出几种吸收较好的有机锌源,采用原位结扎灌注肠段法研究在高植酸条件下,有机锌的吸收是否好于无机锌,进一步验证在消化道逆环境中有机锌相对于无机锌的优越性。采用4×3双因子完全随机设计,取肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠灌注,灌注液中分别添加试验二中确定的吸收效果较好的三种有机锌源:弱络合强度（Qf 6.48 ）的复合氨基酸锌（ZnAAC）、中等络合强度（Qf 30.73）的锌蛋白盐B（ZnProB）和偏极强络合强度（Qf 944.02）的锌蛋白盐A（ZnProA）,还有硫酸锌,并在添加四种锌源的灌注液中分别添加植酸,使其与锌摩尔比分别为2:1和10:1或不添加植酸,同时设置不添加锌与植酸的空白对照组,共13个处理。结果表明:1)无论是有机锌还是无机锌,在不同植酸添加水平下,其在回肠的锌吸收均显著高于十二指肠,为十二指肠的1-2倍（P<0.005）,也高于空肠,除不添加植酸的弱和中等络合强度有机锌组差异显著外（P<0.05）,其余各组二个肠段间差异不显著（P≥0.1172）,再次表明,回肠是肉仔鸡小肠锌吸收的主要部位。2)植酸水平与锌源互作非常显著（P<0.0001）。在肉仔鸡十二指肠、空肠及回肠中,当添加植酸与锌的摩尔比为2:1时,硫酸锌组锌吸收比未添加植酸的硫酸组分别降低9.06%（P=0.1020）、6.17%（P=0.0006）及3.50%（P =0.0083）;弱络合强度ZnAAC组锌吸收比未添加植酸的ZnAAC组分别降低4.73%（P=0.3998）、6.40%（P=0.0009）及5.75%（P<0.0001）;中等络合强度ZnProB组锌吸收比未添加植酸的ZnProB组分别降低7.09%（P=0.1814）、5.14%（P=0.0050）及5.66%（P< 0.0001）;偏极强络合强度ZnProA组锌吸收比未添加植酸的ZnProA组分别降低5.30%（P= 0.3416）、3.82%（P=0.1195）及3.13%（P=0.0199）。当添加植酸与锌的摩尔比为10:1时,硫酸锌组锌吸收比未添加植酸的硫酸组分别降低40.22%、25.65%及21.34%（P<0.0001）;弱络合强度ZnAAC组锌吸收比未添加植酸的ZnAAC组分别降低50.18%、20.54%及19.49%（P <0.0001）;中等络合强度ZnProB组锌吸收比未添加植酸的ZnProB组分别降低34.75%、24.12%及23.27%（P<0.0001）;偏极强络合强度ZnProA组锌吸收比未添加植酸的ZnProA组分别降低8.13%（P=0.1387）、8.28%（P<0.0001）及8.46%（P<0.0001）。添加植酸与锌的摩尔比为10:1与2:1相比时,除十二指肠中偏极强络合强度ZnProA组锌吸收差异不显著外（P= 0.5918）,其余各组各肠段的锌吸收均有明显差异（P<0.02）。说明在肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠中,添加植酸明显降低不同形态锌的吸收率,并且随植酸与锌的摩尔比增加,锌吸收降低幅度增加,这种影响在十二指肠中表现得更为明显;不同络合强度的有机锌均表现出一定的抗植酸络合作用,从而降低植酸对锌吸收的负面影响。其中,在肉仔鸡三个肠段中,偏极强络合强度有机锌在消化道中不易解离,更能抵抗植酸的络合作用从而更有利于锌的吸收。试验四在前面试验的基础上,采用原位结扎灌注肠段法深入研究不同形态及络合强度锌的吸收动力学特点,探讨其在肉仔鸡小肠中吸收存在差异的机理。采用4×6双因子完全随机设计,取肉仔鸡十二指肠灌注,灌注液中添加无机锌及试验二和试验三确定的吸收效果比较好的弱络合强度（Qf 6.48）的复合氨基酸锌（ZnAAC）、中等络合强度（Qf 30.73 ）的锌蛋白盐B（ZnProB）和偏极强络合强度（Qf 944.02）的锌蛋白盐A（ZnProA）共四种锌源,锌添加水平分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/ml。同时设置不添加锌的空白对照组,共25个处理。结果表明:1)在5μg/ml和10μg/ml锌添加水平下,不同形态锌间锌吸收速率无显著差异（P≥0.2759）;而在其余锌添加水平下,有机锌组锌吸收均高于无机锌。2)对不同形态锌吸收速率随其添加水平的变化趋势进行非线性回归拟合,发现肉仔鸡十二指肠中不同形态锌的吸收均为饱和载体参与调节的过程。有机锌与无机锌的吸收机理一样,说明有机锌可以通过无机锌的吸收途径被吸收,即有机锌通过避免肠腔中沉淀剂对矿物元素的沉淀或吸附作用（试验三结果表明不同络合强度有机锌可以抵抗植酸的络合从而更多地被吸收）,而直接到达小肠刷状缘,并在吸收位点处发生水解,其中的锌以离子形式被吸收。另外,随有机锌的络合强度增加,其Km值也逐渐递增,且均高于无机锌。Jmax也表现出同样的变化趋势（P<0.01）。说明虽然不同形态锌的吸收均为饱和载体调节过程,但参与锌吸收的锌转运蛋白种类或表达量可能不同,因为锌转运蛋白不同,其与锌的结合能力是不同的。3)与不添加锌的空白对照组相比,灌注液中添加不同形态锌均增加肉仔鸡十二指肠中MTmRNA表达量。其中,不同络合强度有机锌组MTmRNA水平为对照组的1.5-2倍（P<0.07）,而ZnSO4组为对照组的1.2倍左右（P=0.4156）。偏极强络合强度ZnProA组MTmRNA水平最高,高于弱络合强度ZnAAC组（P=0.2290）,显著高于中等络合强度ZnProB组和ZnSO4组（P<0.03）。弱络合强度ZnAAC组MTmRNA水平高于中等络合强度ZnProB组（P=0.2628）,显著高于ZnSO4组（P=0.0324）。中等络合强度ZnProB组和ZnSO4MTmRNA水平间无显著差异（P=0.2835）。说明补锌确可增加MT转录水平的基因表达。而与无机锌相比,不同络合强度有机锌均可增加MTmRNA表达量,其中中等络合强度有机锌组与无机锌组间无显著差异,而偏极强和弱络合强度有机锌组则显著高于无机锌组（P<0.04）。由于MT的表达与锌吸收呈反比,因此本试验中有机锌组MT表达高于无机锌组无法解释有机锌吸收好于无机锌,说明还有其它的锌转运蛋白参与调节锌吸收,并进一步验证吸收动力学研究结果,即参与调节不同形态锌吸收的转运载体的种类或者表达量不同。试验五采用全体内法-自然饲喂法研究在保持机体正常生理状态下,不同形态及络合强度有机锌对肉仔鸡肝门静脉血浆锌含量及其小肠中MTmRNA水平的影响,探讨其吸收差异及机理,以进一步验证前面的试验结果。采用单因子完全随机试验设计,饲粮中按肉鸡锌营养需要量分别添加硫酸锌、试验二和试验三确定的吸收效果比较好的弱络合强度（Qf 6.48）的复合氨基酸锌（ZnAAC）、中等络合强度（Qf 30.73 ）的锌蛋白盐B（ZnProB）和偏极强络合强度（Qf 944.02）的锌蛋白盐A（ZnProA）共四种锌源,同时设置不添加锌的空白对照组,共5个处理。结果表明:1)在试验的第7天（21日龄）,无机硫酸锌组、弱络合强度、中等络合强度及偏极强络合强度有机锌组鸡肝门静脉血浆锌含量比对照组增加了23.44%-34.48%（P<0.005）。而不同络合强度有机锌组血浆锌含量比硫酸锌组增加了6.75%-8.86%（P≥0.1571）。在第14天（28日龄）,无机硫酸锌组、弱络合强度、中等络合强度及偏极强络合强度有机锌组血浆锌含量比对照组增加了31.94%-42.93%（P<0.0001）,而其中偏极强络合强度有机锌组血浆锌含量比中等络合强度有机锌组增加了1.49%（P=0.7415）,比弱络合强度有机锌组和硫酸锌组增加了7.48%-8.33%（P<0.07）;中等络合强度有机锌组血浆锌含量高于无机硫酸锌组和弱络合强度有机锌组,但差异不显著（P≥0.1029）。无机硫酸锌组和弱络合强度有机锌组血浆锌含量无显著差异（P=0.9156）。说明有机锌的吸收好于无机锌,且偏极强络合强度有机锌吸收效果最好。2)在三个肠段中,与不添加锌的空白对照组相比,饲粮中添加不同形态锌均显著增加肉仔鸡MTmRNA表达量（P<0.0001）。其中,在十二指肠和回肠中,不同形态锌间MTmRNA水平差异不显著（P≥0.2727）;在空肠中,不同形态锌间MTmRNA水平差异显著（P<0.0001）。其中,弱络合强度ZnAAC组MTmRNA水平高于ZnSO4组和偏极强络合强度ZnProA组（P≥0.4649）,显著高于中等络合强度ZnProB组（P<0.03）。而ZnSO4组MTmRNA水平高于偏极强络合强度ZnProA组（P=0.7817）,显著高于中等络合强度ZnProB组（P=0.0601）。中等络合强度ZnProB组和偏极强络合强度ZnProA组MTmRNA水平间无显著差异（P=0.1051）。同一锌源在不同肠段中MTmRNA水平差异显著（P<0.0001）。其中,除空白对照组与中等络合强度ZnProB组在回肠中的MTmRNA水平低于空肠（P≥0.1663）,显著低于十二指肠（P<0.0003）,而空肠又显著低于十二指肠（P<0.003）外,其余锌源在回肠中的MTmRNA水平均显著低于空肠和十二指肠（P<0.001）,而空肠又显著低于十二指肠（P<0.0001）。说明与无机锌相比,不同络合强度有机锌均可增加肉仔鸡小肠中MTmRNA表达量,其中中等络合强度有机锌组与无机锌组间无显著差异,而偏极强和弱络合强度有机锌组则显著高于无机锌组。并且由于MT的表达与锌吸收呈反比,因此有机锌组MT表达高于无机锌组无法解释有机锌吸收好于无机锌,再次说明可能还有其它的锌转运蛋白参与调节锌吸收。另外,本试验中不同锌源在回肠的MTmRNA水平均最低,明显低于十二指肠和空肠。该结论与试验一研究结果一致,提示有机锌在回肠的吸收途径可能与无机锌类似,也是通过不依赖于载体调节的非饱和扩散被吸收的。而且本试验结果进一步验证了试验四的推测,即有机锌吸收极有可能符合竞争吸收假说,即可解离成离子后通过无机锌的吸收途径被吸收。综上所述,螯合的有机锌在肉仔鸡小肠中的吸收率比无机形态锌高,且有机锌的络合强度与其在肉仔鸡小肠内的吸收有密切相关性,其中偏极强络合强度有机锌的吸收最好,中等络合强度有机锌的次之,弱络合强度有机锌的较差。而且,不同络合强度有机锌均表现出一定的抗植酸络合作用,从而降低植酸对锌吸收的负面影响。其中,偏极强络合强度有机锌在消化道中不易解离,更能抵抗植酸的络合作用从而更有利于锌的吸收。有机锌在十二指肠中的吸收机制与无机锌一样,均以饱和载体调节为主;与无机锌相比,有机锌可增加肉鸡小肠MT基因表达,不同形态锌有可能通过对其它锌转运蛋白如ZnT1和ZnT5等表达的不同调节从而导致其吸收存在差异。有机锌吸收极有可能符合竞争吸收假说,即有机锌可以通过无机锌的吸收途径被吸收。以上研究新成果对于我国肉鸡生产中科学研制开发和应用适宜络合强度的新型高效有机锌添加剂,以促进肉鸡生长发育,同时减少锌排出对环境的污染,保护生态平衡,都具有十分重要的理论与现实指导意义。