论文摘要
激肽释放酶是一种丝氨酸蛋白酶,分为组织激肽释放酶和血浆激肽释放酶两类。组织激肽释放酶中又以胰激肽释放酶应用最为广泛,它具有调节血压、改善血液循环的功效,在临床上有着重要作用,被用于治疗高血压、动脉粥样硬化等疾病,受到了医药行业的广泛关注。我国具有丰富的脏器资源,成本低廉,而胰脏中富含胰激肽释放酶,因此利用胰脏作为原料,将胰激肽释放酶进行分离纯化对医药行业有着巨大的经济利益。国内虽已有几十年的研究历史,但回收率高、工艺简便、周期短的方法仍欠缺,值得进一步探究。本文对激肽释放酶分离纯化过程中盐析、超滤、离子交换层析等方法中各项参数进行了详细研究,并建立了一套检测手段,且经过长时间的稳定性验证,下研究结果总结如下：1、研究了胰蛋白酶抑制剂对激肽释放酶活性检测的影响,结果表明在检测时加入过量的胰蛋白酶抑制剂能有效的抑制粗酶中的胰蛋白酶与底物N-苯甲酰-L精氨酸乙酯（BAEE）的反应,从而使测定结果更加准确可靠。2、研究了硫酸铵浓度对激肽释放酶活性检测的影响,设计分别加入0-0.5M的硫酸铵梯度进行检测,结果发现,即使是0.5M硫酸铵的加入对检测结果的影响也很微小,可以忽略盐析过程中硫酸铵对检测结果造成的影响。3、研究了盐析沉淀时间对效果的影响,对加入硫酸铵后静置30 min、60min、 90 min、120 min后上清液中的激肽释放酶进行检测,结果发现,90 min时已沉淀完全,此时能取得最佳效果。4、研究了盐析沉淀范围,分别设计20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%等6个不同沉淀范围进行研究,结果发现在20%-70%的盐析范围内均有不同程度激肽释放酶析出,综合考虑总活力及比活,确定盐析范围为20%-70%。5、研究了盐析后的超滤参数,利用10 KD的超滤膜分别对2×、4×、8×超滤浓缩后的效果进行考查,结果表明2×超滤浓缩的回收率最高,酶活的损失最小,因此确定超滤浓缩为2×。6、通过单因素试验对离子交换层析中的上样条件进行研究,研究内容包括吸附pH的选择、吸附盐离子浓度选择及洗脱盐浓度等。确定了最佳上样条件：平衡液采用0.02M pH 5.5的NaAc-HAc缓冲溶液,洗脱液采用含0.36M NaCl的0.02M pH 5.5的NaAc-HAc缓冲溶液。7、利用得到的最佳上样条件对样品进行DEAE-Sepharose FF层析,并收集到一个洗脱峰,检测发现纯度较高,比活达到403.62 U/mg,活性回收率为73.19%,纯化倍数达到29.77倍。