C-反应蛋白的变构及其单体的功能

论文摘要

长期以来,C反应蛋白（CRP）作为炎症标示因子应用于临床检测,用来表征急性炎症。近期研究表明,CRP在与漫性炎症相关的心血管疾病中扮演着重要的角色,不仅是预报因子而且直接参与了粥样硬化及血栓形成。然而,CRP参与病理过程的机制并未明确,研究结果还存在争议。除了研究方法的原因外,CRP存在不同的天然异构体形式（五聚体pCRP和单体mCRP）可以更为合理的解释目前研究中所存在的争议。五聚体pCRP具有蛋白“库”的作用,而局部病变区中可能由pCRP变构而来的mCRP则是蛋白的功能态。但是,对于mCRP产生及功能发挥的分子机制尚不清楚。流式检测证明pCRP能够与单核细胞结合及内化,且结合方式可能为受体介导。电泳、荧光及酶联吸附则证明pCRP在适度低pH及活性氧自由基（常出现在炎性病变区）的诱导下能够很快完成五聚体到单体的变构。我们进一步确定了Cu2+-H2O2系统在自由基诱导变构方面存在结合诱导的特异性,而体内大量存在的铜蓝蛋白则可作为此过程的金属离子供体。综上可提出一个CRP的变构模型,即炎性期血浆中CRP的飙升便利了其与单核细胞的结合,而单核细胞从血液向炎性区的迁移将CRP携带到炎症位点,局部特殊的酸性环境及自由基的大量存在促进了CRP的变构。这对体内CRP的大范围飙升如何精细调控局部病变区的细胞应答及病理过程提供了一个合理的解释。另外,我们发现无论在固相或液相体系中,CRP都主要以单体形式与纤粘连蛋白（FN）结合,间接证明了CRP是以单体形式参与CVD早期阶段的损伤修复。多肽竞争实验基本确定了mCRP与FN结合的位点为胆固醇结合位点aa35-47,且这种结合能够促进单核细胞在FN上的粘附,说明mCRP在病变早期具有促炎效果。除此之外,我们用小鼠和兔子的动物实验,也证实了mCRP（特别是还原态mCRP）在诱导表达白介素方面具有更高的生物学效应。可以认为CRP功能的发挥必须依赖于五聚体结构的解聚,形成的mCRP通过巯基这个“功能开关”发挥更高效的促炎效应。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 C-反应蛋白简介
• 1.1.1 基本结构
• 1.1.2 配体及受体
• 1.1.3 表达调控
• 1.1.4 异构体类型
• 1.2 CRP与炎症
• 1.2.1 CRP的促炎作用
• 1.2.2 CRP的抗炎作用
• 1.2.3 CRP制备对其生物学效应的影响
• 1.3 CRP与心血管疾病
• 1.3.1 流行病学调查及临床研究
• 1.3.2 CRP参与心血管疾病的病理过程
• 1.4 CRP在动物模型中的研究
• 1.5 解决领域内争议的新思路
• 1.6 本文的研究内容及意义
• 第二章 材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 蛋白
• 2.1.2 细胞及动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 蛋白部分实验方法
• 2.2.1 CRP蛋白的纯化
• 2.2.2 CRP蛋白的标记
• 2.2.3 mCRP的制备和纯化
• 2.2.4 蛋白质的定量测定
• 2.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳及凝胶染色
• 2.2.6 分子筛（SEC）
• 2.2.7 蛋白免疫印记（Western Blotting,WB）
• 2.2.8 免疫共沉淀（IP）
• 2.2.9 蛋白质荧光检测
• 2.2.10 酶联免疫吸附（ELISA）
• 2.3 细胞部分实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 细胞冻存
• 2.3.3 流式细胞术（FCM）
• 2.3.4 细胞粘附
• 2.4 动物部分实验方法
• 2.4.1 兔颈总动脉及胸主动脉血管的离体及培养
• 2.4.2 小鼠腹腔积液的收集及检测
• 2.4.3 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导和收集
• 第三章 CRP的体外及胞内变构
• 3.1 C-反应蛋白五聚体的体外变构
• 3.1.1 研究背景
• 3.1.2 低pH条件诱导CRP构象转变
• 3.1.3 CRP构象改变造成蛋白抗原性的变化
• 3.1.4 适度酸度条件下自由基诱导的CRP构象转变
• 3.2 C-反应蛋白五聚体的胞内变构
• 3.2.1 研究背景
• 3.2.2 WB检测CRP与细胞的结合
• 3.2.3 C-反应蛋白与单核细胞的结合和内化
• 第四章 单体CRP（mCRP）的配体结合能力及其生物活性
• 4.1 CRP通过单体形式与纤粘连蛋白（FN）结合
• 4.1.1 研究背景
• 4.1.2 mCRP是CRP与FN结合的主要异构体形式
• 4.1.3 mCRP与FN的结合位点的确定
• 4.1.4 mCRP与FN的液相结合
• 4.1.5 mCRP与FN结合的细胞效应
• 4.2 mCRP对兔离体血管及小鼠腹腔细胞的激活作用
• 第五章 结果与讨论
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 致谢