HBx对肝癌细胞内源性Survivin表达的影响

论文摘要

目的Survivin（存活素）是细胞凋亡抑制蛋白家族（IAP）中的一个成员,X基因是HBV基因组里最小的开放读码框（ORF）,它与HCC的发生发展关系最密切。探讨X基因对内源性survivin表达的影响以及分析比较survivin在肝炎、肝硬化以及肿瘤组织中的表达,进一步探讨survivin在HBV感染的慢性乙型肝炎患者发展成HCC的可能分子机制奠定理论及实验基础。研究方法用脂质体LipofectmineTM2000分别将pcDNA3.1-HBx（表达X基因）和空质粒pcDNA3.1导入HepG2细胞,另设一组未转染任何质粒为空白对照。转染48小时后分别予G418进行筛选建立稳定细胞株,进行以下实验:（1）应用免疫细胞化学技术检测HBx的表达。（2）应用免疫细胞化学技术定性检测实验组和对照组中survivin的表达。（3）提取各组细胞总蛋白,通过蛋白免疫印迹（Western Bloting）方法比较各组survivin的表达量,进一步印证细胞免疫技术的结果。（4）收集本院经病理证实的20例原发性肝细胞肝癌组织标本（其中低分化9例,中分化7例,高分化4例）以及30例肝炎组织标本（含早期肝硬化组织标本10例,病理分级:G2/S2～G4/S4）,通过免疫组织化学技术检测survivin的表达。结果免疫细胞化学法显示转染了pcDNA3.1-HBx质粒的细胞内有HBx的表达,棕黄色颗粒分布于胞浆中。转染pcDNA3.1组和未转染组则无表达,证明质粒转染成功。转染组细胞用G418筛选20天得到抗性克隆（终浓度维持400μg╱ml）,即建立了稳定细胞株。免疫细胞化学法显示三组细胞内均有Survivin表达,棕黄色颗粒分布于胞浆中,但以转染了pcDNA3.1-HBx质粒的细胞Survivin蛋白表达最明显,较转染了pcDNA3.1组和空白组具有显著的统计学意义（P＜0.05）。Wstern Bloting检测各组细胞Survivin蛋白的表达量,转染X基因表达质粒pcDNA3.1-HBx的细胞Survivin表达明显高于转染pcDNA3.1组和未转染组,进一步印证了免疫细胞化学技术结果。说明X基因可促进内源性Survivin的表达。免疫组织化学法显示20例肝癌组织中17例有Survivin蛋白的表达（17/20,阳性率为85%）,棕黄色颗粒分布于肝癌细胞的胞浆中,阳性细胞在HCC组织里呈散在分布,其中58.8%（10/17）呈强阳性表达,23.5%（4/17）呈中阳性表达,17.7%（3/17）呈弱阳性表达,表达的阳性强度考虑与其相应的病理组织恶性程度分期有关。20例肝炎组织中2例有Survivin蛋白的表达（2/20,阳性率为10%）和10例早期肝硬化组织中3例有Survivin蛋白的表达（3/10,阳性率为30%）。HCC组织中Survivin的表达水平较肝炎组织和早期肝硬化组织显著增高,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。结论成功地将含X基因表达质粒pcDNA3.1-HBx转染至HepG2细胞中,并建立了稳定细胞株;X基因可以促进内源性survivin蛋白的表达,这可能是HBV感染的慢性乙型肝炎患者发展至HCC分子机制之一;Survivin蛋白在不同组织表达的特异性,可作为HCC诊断指标和药物研治的新靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英汉缩略词对照表
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第三章 结果
• 3.1 酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定
• 3.2 免疫细胞化学分析HBx在HepG2细胞内的表达
• 3.3 免疫细胞化学分析Survivin在HepG2细胞内的表达
• 3.4 Western Bloting 显示Survivin在三组细胞中的表达
• 3.5 Survivin蛋白在HCC、肝炎及早期肝硬化组织中的表达
• 3.6 统计学处理
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果